Przygotowanie próbek histologicznych do mikroskopii świetlnej
Histologia to termin odnoszący się do badania mikroskopowej anatomii tkanek i komórek. Prawidłowe przygotowanie próbek histologicznych do mikroskopii świetlnej jest niezbędne do uzyskania wysokiej jakości wyników z próbek tkankowych.
Istnieją 3 główne etapy wspólne dla niemal wszystkich procedur histologicznych. Po pierwsze, próbkę utrwala się, aby zachować strukturę tkanki i spowolnić jej degradację. Następnie próbkę zanurza się w materiale, czyli medium zatopowym, który posiada podobne właściwości mechaniczne do badanej tkanki. Po zatopieniu próbkę poddaje się sekcjonowaniu, czyli cięciu na cienkie plastry, przy użyciu precyzyjnego narzędzia tnącego zwanego mikrotomem. Niniejszy film opisuje te ogólne etapy oraz niektóre powiązane z nimi pojęcia.
Fiksacja tkanek jest krytycznym etapem, który pozwala na zachowanie składników komórek i tkanek oraz utrzymanie ich struktury. Po śmierci komórki z organelli komórkowych uwalniane są naturalnie występujące enzymy, które zaczynają degradować białka w całej komórce i macierzy zewnątrzkomórkowej, niszcząc tym samym strukturę komórki. Fiksacja zapobiega takiej degradacji poprzez bezpośrednie hamowanie zdolności tych enzymów do trawienia białek oraz sprawienie, że miejsca cięcia enzymatycznego stają się nierozpoznawalne.
Dwa główne mechanizmy fiksacji to sieciowanie i koagulacja. Sieciowanie polega na tworzeniu wiązań kowalencyjnych zarówno w obrębie białek, jak i między nimi, co powoduje usztywnienie tkanki i tym samym jej odporność na degradację. Koagulacja jest spowodowana odwodnieniem białek poprzez zastosowanie alkoholi lub acetonu, co deformuje strukturę trzeciorzędową białek, w wyniku czego regiony hydrofobowe, czyli „bojące się wody”, przemieszczają się na powierzchnię białka. Fiksacja koagulacyjna może pomóc mediom zatapiającym, takim jak parafina, w penetracji tkanki.
Jednym z najczęściej stosowanych utrwalaczy jest formalina, która jest formaldehydem rozpuszczonym w wodzie. Podczas fiksacji formaldehyd przyłącza się do amin pierwszorzędowych, takich jak te występujące w łańcuchach bocznych aminokwasów lizyny i glutaminy, tworząc trwałe wiązanie sieciujące zwane mostkiem metylenowym. Proces ten jest z natury powolny i może trwać od 1 do 2 dni.
Przed przystąpieniem do fiksacji należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. Po pierwsze, należy rozważyć dyfuzyjność próbki. Utrwalacze dyfundują przez tkanki na odległość zależną od współczynnika dyfuzji utrwalacza pomnożonego przez pierwiastek kwadratowy z czasu. Utrwalacz, który potrzebuje 1 godziny, aby wniknąć na 1 mm w głąb próbki, będzie potrzebował 25 godzin, aby wniknąć na 5 mm. Gdy formalina dotrze do centrum tkanki, wciąż musi zajść reakcja sieciowania. Zatem w celu zapewnienia dokładnej fiksacji w rozsądnym czasie, grubość próbki powinna być ograniczona do 4 mm.
Po drugie, należy rozważyć objętość i pH utrwalacza. Stosunek objętości utrwalacza do objętości próbki powinien wynosić co najmniej 40:1, aby odczynnik nie został szybko zużyty w czasie. Podczas gdy niektóre utrwalacze są zaprojektowane do pracy w pH kwasowym, formalina działa najlepiej, gdy jest buforowana fosforanem w celu utrzymania neutralnego pH, aby nie powstawał nadmiar kwasu, który powoduje artefakty w tkance.
Kolejnym krokiem w przygotowaniu histologicznym jest zatapianie, które polega na unieruchomieniu preparatów w medium o sztywności mechanicznej zbliżonej do sztywności samego preparatu. Wybór odpowiedniego medium do zatapiania jest krytyczny, ponieważ zbyt duża lub zbyt mała sztywność może prowadzić do wystąpienia defektów podczas skrawania. Najpowszechniejszym medium stosowanym do zatapiania jest parafina.
Przed zatopieniem w parafinie próbki muszą zostać odwodnione poprzez zastąpienie wody w tkance najpierw etanolem, następnie ksylenami, a na koniec podgrzaną parafiną. Po nasyceniu próbki woskiem, zostaje ona ostrożnie ustawiona i otoczona dodatkową ilością parafiny w formie, aby utworzyć bloczek. Następnie próbki są mocowane do kasety histologicznej w celu ich skrawania.
Skrawanie jest procesem wycinania cienkich plastrów próbki z bloczka z zatopioną tkanką. Skrawane sekcje mają zazwyczaj grubość rzędu 4-10 µm, co umożliwia ich wykorzystanie w mikroskopii świetlnej.
Aby wykonać skrawanie, w mikrotomie mocuje się najpierw metalowe, szklane lub diamentowe ostrze. Następnie próbkę umieszcza się w uchwycie na próbkę. W kolejnym kroku próbka jest przesuwana w stronę powierzchni tnącej i prowadzona wzdłuż ostrza, aby uzyskać plaster o pożądanej grubości. Sekcje gromadzą się w postaci cienkich wstążek, które można przenieść na szkiełka podstawowe.
Po skrawaniu próbki są umieszczane na szkiełkach. W przypadku próbek zatopionych w parafinie, plastry nanosi się najpierw do podgrzanej kąpieli wodnej, a następnie wyjmuje z wody bezpośrednio na szkiełko i pozostawia do wyschnięcia.
Tkanka biologiczna charakteryzuje się bardzo niskim naturalnym kontrastem, dlatego po przeprowadzeniu badań histologicznych preparaty są zazwyczaj barwione barwnikami lub przeciwciałami, które uwydatniają morfologię lub specyficzne białka. Najczęściej stosowanym barwieniem jest barwienie hematoksyliną i eozyną, czyli H&E. Ze względu na jego powszechność stworzono wiele zautomatyzowanych urządzeń pozwalających na powtarzalne barwienie licznych skrawków metodą H&E. Hematoksylina barwi jądra komórkowe na niebiesko, a eozyna barwi cytoplazmę na różowo, co pozwala uwidocznić morfologię komórkową tkanek.
Jedną z wad fiksacji jest to, że sieciowanie białek może utrudnić przeciwciałom znakującym dotarcie do ich miejsc wiązania. Zamiast stosowania fiksacji w celu utrwalenia próbek, można zastosować szybkie mrożenie tkanki, tzw. snap freezing, po którym następuje technika cięcia zwana kriosekcjonowaniem.
Próbki tkanek są zatapiane i orientowane w specjalnym medium mrożącym zwanym OCT (optimal cutting temperature medium), a następnie szybko mrożone. Podobnie jak inne media do zatapiania, OCT dopasowuje się do sztywności próbki.
Do wycinania skrawków mrożonych używa się kriomikrotomu lub kriotomatu; urządzenie to utrzymuje temperaturę wewnętrzną na poziomie -20°C, aby ostrze tnące i próbki pozostały schłodzone. W przeciwieństwie do skrawków zatopionych w parafinie, skrawki mrożone można przenieść bezpośrednio na dodatnio naładowane szkiełko przedmiotowe natychmiast po sekcjonowaniu.
Innym sposobem uniknięcia fiksacji jest zatapianie w agarze, w którym próbki pokrywa się świeżo przygotowaną płynną agarozą. W miarę stygnięcia agaroza unieruchamia tkankę, a nadmiar agarozy można odciąć.
Wibrotomy, będące kolejną alternatywą dla mikrotomu, posiadają ostrze, które wibruje i przesuwa się przez próbkę zatopioną w agarozie. Wibrotomy są wykorzystywane do tworzenia grubych skrawków o grubości rzędu 50-1000 µm z próbek zatopionych w agarozie.
Próbki są zazwyczaj usuwane z agarozy przed barwieniem, a następnie umieszczane na szkiełku w otoczeniu substancji takiej jak smar próżniowy, który zapobiega zgniataniu próbki przez szkiełko nakrywkowe. Najlepiej obserwować je przy użyciu mikroskopii konfokalnej, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości dla każdego grubego skrawka.
Właśnie obejrzeli Państwo film JoVE na temat przygotowania próbek histologicznych do mikroskopii świetlnej.
Powinni Państwo teraz rozumieć etapy przygotowania próbek, które prowadzą od fragmentu tkanki do możliwości uzyskania barwionego skrawka. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Histologia jest nauką o komórkach i tkankach, w której zazwyczaj wykorzystuje się mikroskop świetlny. Przygotowanie próbek histologicznych może się zn…
Histologia to termin odnoszący się do badania mikroskopowej anatomii tkanek i komórek. Prawidłowe przygotowanie próbek histologicznych do mikroskopii świetlnej jest niezbędne do uzyskania wysokiej jakości wyników z próbek tkankowych.
Istnieją 3 główne etapy wspólne dla niemal wszystkich procedur histologicznych. Po pierwsze, próbkę utrwala się, aby zachować strukturę tkanki i spowolnić jej degradację. Następnie próbkę zanurza się w materiale, czyli medium zatopowym, który posiada podobne właściwości mechaniczne do badanej tkanki. Po zatopieniu próbkę poddaje się sekcjonowaniu, czyli cięciu na cienkie plastry, przy użyciu precyzyjnego narzędzia tnącego zwanego mikrotomem. Niniejszy film opisuje te ogólne etapy oraz niektóre powiązane z nimi pojęcia.
Fiksacja tkanek jest krytycznym etapem, który pozwala na zachowanie składników komórek i tkanek oraz utrzymanie ich struktury. Po śmierci komórki z organelli komórkowych uwalniane są naturalnie występujące enzymy, które zaczynają degradować białka w całej komórce i macierzy zewnątrzkomórkowej, niszcząc tym samym strukturę komórki. Fiksacja zapobiega takiej degradacji poprzez bezpośrednie hamowanie zdolności tych enzymów do trawienia białek oraz sprawienie, że miejsca cięcia enzymatycznego stają się nierozpoznawalne.
Dwa główne mechanizmy fiksacji to sieciowanie i koagulacja. Sieciowanie polega na tworzeniu wiązań kowalencyjnych zarówno w obrębie białek, jak i między nimi, co powoduje usztywnienie tkanki i tym samym jej odporność na degradację. Koagulacja jest spowodowana odwodnieniem białek poprzez zastosowanie alkoholi lub acetonu, co deformuje strukturę trzeciorzędową białek, w wyniku czego regiony hydrofobowe, czyli „bojące się wody”, przemieszczają się na powierzchnię białka. Fiksacja koagulacyjna może pomóc mediom zatapiającym, takim jak parafina, w penetracji tkanki.
Jednym z najczęściej stosowanych utrwalaczy jest formalina, która jest formaldehydem rozpuszczonym w wodzie. Podczas fiksacji formaldehyd przyłącza się do amin pierwszorzędowych, takich jak te występujące w łańcuchach bocznych aminokwasów lizyny i glutaminy, tworząc trwałe wiązanie sieciujące zwane mostkiem metylenowym. Proces ten jest z natury powolny i może trwać od 1 do 2 dni.
Przed przystąpieniem do fiksacji należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. Po pierwsze, należy rozważyć dyfuzyjność próbki. Utrwalacze dyfundują przez tkanki na odległość zależną od współczynnika dyfuzji utrwalacza pomnożonego przez pierwiastek kwadratowy z czasu. Utrwalacz, który potrzebuje 1 godziny, aby wniknąć na 1 mm w głąb próbki, będzie potrzebował 25 godzin, aby wniknąć na 5 mm. Gdy formalina dotrze do centrum tkanki, wciąż musi zajść reakcja sieciowania. Zatem w celu zapewnienia dokładnej fiksacji w rozsądnym czasie, grubość próbki powinna być ograniczona do 4 mm.
Po drugie, należy rozważyć objętość i pH utrwalacza. Stosunek objętości utrwalacza do objętości próbki powinien wynosić co najmniej 40:1, aby odczynnik nie został szybko zużyty w czasie. Podczas gdy niektóre utrwalacze są zaprojektowane do pracy w pH kwasowym, formalina działa najlepiej, gdy jest buforowana fosforanem w celu utrzymania neutralnego pH, aby nie powstawał nadmiar kwasu, który powoduje artefakty w tkance.
Kolejnym krokiem w przygotowaniu histologicznym jest zatapianie, które polega na unieruchomieniu preparatów w medium o sztywności mechanicznej zbliżonej do sztywności samego preparatu. Wybór odpowiedniego medium do zatapiania jest krytyczny, ponieważ zbyt duża lub zbyt mała sztywność może prowadzić do wystąpienia defektów podczas skrawania. Najpowszechniejszym medium stosowanym do zatapiania jest parafina.
Przed zatopieniem w parafinie próbki muszą zostać odwodnione poprzez zastąpienie wody w tkance najpierw etanolem, następnie ksylenami, a na koniec podgrzaną parafiną. Po nasyceniu próbki woskiem, zostaje ona ostrożnie ustawiona i otoczona dodatkową ilością parafiny w formie, aby utworzyć bloczek. Następnie próbki są mocowane do kasety histologicznej w celu ich skrawania.
Skrawanie jest procesem wycinania cienkich plastrów próbki z bloczka z zatopioną tkanką. Skrawane sekcje mają zazwyczaj grubość rzędu 4-10 µm, co umożliwia ich wykorzystanie w mikroskopii świetlnej.
Aby wykonać skrawanie, w mikrotomie mocuje się najpierw metalowe, szklane lub diamentowe ostrze. Następnie próbkę umieszcza się w uchwycie na próbkę. W kolejnym kroku próbka jest przesuwana w stronę powierzchni tnącej i prowadzona wzdłuż ostrza, aby uzyskać plaster o pożądanej grubości. Sekcje gromadzą się w postaci cienkich wstążek, które można przenieść na szkiełka podstawowe.
Po skrawaniu próbki są umieszczane na szkiełkach. W przypadku próbek zatopionych w parafinie, plastry nanosi się najpierw do podgrzanej kąpieli wodnej, a następnie wyjmuje z wody bezpośrednio na szkiełko i pozostawia do wyschnięcia.
Tkanka biologiczna charakteryzuje się bardzo niskim naturalnym kontrastem, dlatego po przeprowadzeniu badań histologicznych preparaty są zazwyczaj barwione barwnikami lub przeciwciałami, które uwydatniają morfologię lub specyficzne białka. Najczęściej stosowanym barwieniem jest barwienie hematoksyliną i eozyną, czyli H&E. Ze względu na jego powszechność stworzono wiele zautomatyzowanych urządzeń pozwalających na powtarzalne barwienie licznych skrawków metodą H&E. Hematoksylina barwi jądra komórkowe na niebiesko, a eozyna barwi cytoplazmę na różowo, co pozwala uwidocznić morfologię komórkową tkanek.
Jedną z wad fiksacji jest to, że sieciowanie białek może utrudnić przeciwciałom znakującym dotarcie do ich miejsc wiązania. Zamiast stosowania fiksacji w celu utrwalenia próbek, można zastosować szybkie mrożenie tkanki, tzw. snap freezing, po którym następuje technika cięcia zwana kriosekcjonowaniem.
Próbki tkanek są zatapiane i orientowane w specjalnym medium mrożącym zwanym OCT (optimal cutting temperature medium), a następnie szybko mrożone. Podobnie jak inne media do zatapiania, OCT dopasowuje się do sztywności próbki.
Do wycinania skrawków mrożonych używa się kriomikrotomu lub kriotomatu; urządzenie to utrzymuje temperaturę wewnętrzną na poziomie -20°C, aby ostrze tnące i próbki pozostały schłodzone. W przeciwieństwie do skrawków zatopionych w parafinie, skrawki mrożone można przenieść bezpośrednio na dodatnio naładowane szkiełko przedmiotowe natychmiast po sekcjonowaniu.
Innym sposobem uniknięcia fiksacji jest zatapianie w agarze, w którym próbki pokrywa się świeżo przygotowaną płynną agarozą. W miarę stygnięcia agaroza unieruchamia tkankę, a nadmiar agarozy można odciąć.
Wibrotomy, będące kolejną alternatywą dla mikrotomu, posiadają ostrze, które wibruje i przesuwa się przez próbkę zatopioną w agarozie. Wibrotomy są wykorzystywane do tworzenia grubych skrawków o grubości rzędu 50-1000 µm z próbek zatopionych w agarozie.
Próbki są zazwyczaj usuwane z agarozy przed barwieniem, a następnie umieszczane na szkiełku w otoczeniu substancji takiej jak smar próżniowy, który zapobiega zgniataniu próbki przez szkiełko nakrywkowe. Najlepiej obserwować je przy użyciu mikroskopii konfokalnej, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości dla każdego grubego skrawka.
Właśnie obejrzeli Państwo film JoVE na temat przygotowania próbek histologicznych do mikroskopii świetlnej.
Powinni Państwo teraz rozumieć etapy przygotowania próbek, które prowadzą od fragmentu tkanki do możliwości uzyskania barwionego skrawka. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Histologia to termin odnoszący się do badania mikroskopowej anatomii tkanek i komórek. Prawidłowe przygotowanie próbek histologicznych do mikroskopii świetlnej jest niezbędne do uzyskania wysokiej jakości wyników z próbek tkankowych.
Istnieją 3 główne etapy wspólne dla niemal wszystkich procedur histologicznych. Po pierwsze, próbkę utrwala się, aby zachować strukturę tkanki i spowolnić jej degradację. Następnie próbkę zanurza się w materiale, czyli medium zatopowym, który posiada podobne właściwości mechaniczne do badanej tkanki. Po zatopieniu próbkę poddaje się sekcjonowaniu, czyli cięciu na cienkie plastry, przy użyciu precyzyjnego narzędzia tnącego zwanego mikrotomem. Niniejszy film opisuje te ogólne etapy oraz niektóre powiązane z nimi pojęcia.
Fiksacja tkanek jest krytycznym etapem, który pozwala na zachowanie składników komórek i tkanek oraz utrzymanie ich struktury. Po śmierci komórki z organelli komórkowych uwalniane są naturalnie występujące enzymy, które zaczynają degradować białka w całej komórce i macierzy zewnątrzkomórkowej, niszcząc tym samym strukturę komórki. Fiksacja zapobiega takiej degradacji poprzez bezpośrednie hamowanie zdolności tych enzymów do trawienia białek oraz sprawienie, że miejsca cięcia enzymatycznego stają się nierozpoznawalne.
Dwa główne mechanizmy fiksacji to sieciowanie i koagulacja. Sieciowanie polega na tworzeniu wiązań kowalencyjnych zarówno w obrębie białek, jak i między nimi, co powoduje usztywnienie tkanki i tym samym jej odporność na degradację. Koagulacja jest spowodowana odwodnieniem białek poprzez zastosowanie alkoholi lub acetonu, co deformuje strukturę trzeciorzędową białek, w wyniku czego regiony hydrofobowe, czyli „bojące się wody”, przemieszczają się na powierzchnię białka. Fiksacja koagulacyjna może pomóc mediom zatapiającym, takim jak parafina, w penetracji tkanki.
Jednym z najczęściej stosowanych utrwalaczy jest formalina, która jest formaldehydem rozpuszczonym w wodzie. Podczas fiksacji formaldehyd przyłącza się do amin pierwszorzędowych, takich jak te występujące w łańcuchach bocznych aminokwasów lizyny i glutaminy, tworząc trwałe wiązanie sieciujące zwane mostkiem metylenowym. Proces ten jest z natury powolny i może trwać od 1 do 2 dni.
Przed przystąpieniem do fiksacji należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. Po pierwsze, należy rozważyć dyfuzyjność próbki. Utrwalacze dyfundują przez tkanki na odległość zależną od współczynnika dyfuzji utrwalacza pomnożonego przez pierwiastek kwadratowy z czasu. Utrwalacz, który potrzebuje 1 godziny, aby wniknąć na 1 mm w głąb próbki, będzie potrzebował 25 godzin, aby wniknąć na 5 mm. Gdy formalina dotrze do centrum tkanki, wciąż musi zajść reakcja sieciowania. Zatem w celu zapewnienia dokładnej fiksacji w rozsądnym czasie, grubość próbki powinna być ograniczona do 4 mm.
Po drugie, należy rozważyć objętość i pH utrwalacza. Stosunek objętości utrwalacza do objętości próbki powinien wynosić co najmniej 40:1, aby odczynnik nie został szybko zużyty w czasie. Podczas gdy niektóre utrwalacze są zaprojektowane do pracy w pH kwasowym, formalina działa najlepiej, gdy jest buforowana fosforanem w celu utrzymania neutralnego pH, aby nie powstawał nadmiar kwasu, który powoduje artefakty w tkance.
Kolejnym krokiem w przygotowaniu histologicznym jest zatapianie, które polega na unieruchomieniu preparatów w medium o sztywności mechanicznej zbliżonej do sztywności samego preparatu. Wybór odpowiedniego medium do zatapiania jest krytyczny, ponieważ zbyt duża lub zbyt mała sztywność może prowadzić do wystąpienia defektów podczas skrawania. Najpowszechniejszym medium stosowanym do zatapiania jest parafina.
Przed zatopieniem w parafinie próbki muszą zostać odwodnione poprzez zastąpienie wody w tkance najpierw etanolem, następnie ksylenami, a na koniec podgrzaną parafiną. Po nasyceniu próbki woskiem, zostaje ona ostrożnie ustawiona i otoczona dodatkową ilością parafiny w formie, aby utworzyć bloczek. Następnie próbki są mocowane do kasety histologicznej w celu ich skrawania.
Skrawanie jest procesem wycinania cienkich plastrów próbki z bloczka z zatopioną tkanką. Skrawane sekcje mają zazwyczaj grubość rzędu 4-10 µm, co umożliwia ich wykorzystanie w mikroskopii świetlnej.
Aby wykonać skrawanie, w mikrotomie mocuje się najpierw metalowe, szklane lub diamentowe ostrze. Następnie próbkę umieszcza się w uchwycie na próbkę. W kolejnym kroku próbka jest przesuwana w stronę powierzchni tnącej i prowadzona wzdłuż ostrza, aby uzyskać plaster o pożądanej grubości. Sekcje gromadzą się w postaci cienkich wstążek, które można przenieść na szkiełka podstawowe.
Po skrawaniu próbki są umieszczane na szkiełkach. W przypadku próbek zatopionych w parafinie, plastry nanosi się najpierw do podgrzanej kąpieli wodnej, a następnie wyjmuje z wody bezpośrednio na szkiełko i pozostawia do wyschnięcia.
Tkanka biologiczna charakteryzuje się bardzo niskim naturalnym kontrastem, dlatego po przeprowadzeniu badań histologicznych preparaty są zazwyczaj barwione barwnikami lub przeciwciałami, które uwydatniają morfologię lub specyficzne białka. Najczęściej stosowanym barwieniem jest barwienie hematoksyliną i eozyną, czyli H&E. Ze względu na jego powszechność stworzono wiele zautomatyzowanych urządzeń pozwalających na powtarzalne barwienie licznych skrawków metodą H&E. Hematoksylina barwi jądra komórkowe na niebiesko, a eozyna barwi cytoplazmę na różowo, co pozwala uwidocznić morfologię komórkową tkanek.
Jedną z wad fiksacji jest to, że sieciowanie białek może utrudnić przeciwciałom znakującym dotarcie do ich miejsc wiązania. Zamiast stosowania fiksacji w celu utrwalenia próbek, można zastosować szybkie mrożenie tkanki, tzw. snap freezing, po którym następuje technika cięcia zwana kriosekcjonowaniem.
Próbki tkanek są zatapiane i orientowane w specjalnym medium mrożącym zwanym OCT (optimal cutting temperature medium), a następnie szybko mrożone. Podobnie jak inne media do zatapiania, OCT dopasowuje się do sztywności próbki.
Do wycinania skrawków mrożonych używa się kriomikrotomu lub kriotomatu; urządzenie to utrzymuje temperaturę wewnętrzną na poziomie -20°C, aby ostrze tnące i próbki pozostały schłodzone. W przeciwieństwie do skrawków zatopionych w parafinie, skrawki mrożone można przenieść bezpośrednio na dodatnio naładowane szkiełko przedmiotowe natychmiast po sekcjonowaniu.
Innym sposobem uniknięcia fiksacji jest zatapianie w agarze, w którym próbki pokrywa się świeżo przygotowaną płynną agarozą. W miarę stygnięcia agaroza unieruchamia tkankę, a nadmiar agarozy można odciąć.
Wibrotomy, będące kolejną alternatywą dla mikrotomu, posiadają ostrze, które wibruje i przesuwa się przez próbkę zatopioną w agarozie. Wibrotomy są wykorzystywane do tworzenia grubych skrawków o grubości rzędu 50-1000 µm z próbek zatopionych w agarozie.
Próbki są zazwyczaj usuwane z agarozy przed barwieniem, a następnie umieszczane na szkiełku w otoczeniu substancji takiej jak smar próżniowy, który zapobiega zgniataniu próbki przez szkiełko nakrywkowe. Najlepiej obserwować je przy użyciu mikroskopii konfokalnej, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości dla każdego grubego skrawka.
Właśnie obejrzeli Państwo film JoVE na temat przygotowania próbek histologicznych do mikroskopii świetlnej.
Powinni Państwo teraz rozumieć etapy przygotowania próbek, które prowadzą od fragmentu tkanki do możliwości uzyskania barwionego skrawka. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is tissue fixation necessary in histological sample preparation?
Tissue fixation preserves cell and tissue structure by preventing degradation caused by naturally occurring enzymes released after cell death. Fixation inhibits enzyme activity and makes protein cleavage sites unrecognizable. The two main mechanisms are cross-linking, which forms covalent bonds to stiffen tissue, and coagulation, which dehydrates proteins using alcohols or acetone to deform their structure.
Q2: What are the two main mechanisms of tissue fixation?
Cross-linking involves covalent bond formation within and between proteins, causing tissue to stiffen and resist degradation. Coagulation dehydrates proteins through alcohols or acetone, deforming their tertiary structure so hydrophobic regions move to the protein surface. Coagulative fixation helps embedding media like paraffin wax penetrate tissue more effectively.
Q3: How does formalin work as a fixative in tissue preparation?
Formalin, formaldehyde dissolved in water, attaches to primary amines on amino acid side chains like lysine and glutamine, forming stable crosslinks called methylene bridges. This cross-linking process is inherently slow, requiring 1-2 days for completion. Formalin works best when buffered with phosphate to maintain neutral pH and prevent tissue artifacts.
Q4: What factors should be considered before tissue fixation begins?
Consider sample diffusivity: fixatives penetrate tissue at rates related to diffusion coefficient and time, so samples should be limited to 4 mm thickness for thorough fixation. Also consider fixative volume and pH. The fixative-to-sample ratio should be at least 40:1 to prevent reagent depletion. Formalin should be buffered with phosphate to maintain neutral pH and avoid tissue artifacts.
Q5: What is the purpose of embedding media in histological preparation?
Embedding media supports specimens with mechanical rigidity similar to the tissue itself. Paraffin wax is the most common embedding medium. Choosing appropriate embedding media is critical because media that is too stiff or too weak causes sectioning defects. Prior to paraffin embedding, samples must be dehydrated by replacing water with ethanol, then xylenes, and finally warmed paraffin wax.
Q6: How does cryosectioning differ from traditional paraffin-embedded sectioning?
Cryosectioning avoids fixation by rapidly freezing tissue in OCT (optimal cutting temperature) medium, then sectioning with a cryomicrotome maintained at -20°C. Unlike paraffin sections that require water bath treatment, frozen sections are directly lifted onto positively charged glass slides immediately after sectioning. This method preserves protein structure better for antibody labeling since cross-linking does not occur.
Q7: What are alternative embedding methods to paraffin wax?
Agar embedding covers samples with freshly prepared liquid agarose that locks tissue in place as it cools. Vibrotomes with vibrating blades cut thick sections of 50-1000 µm from agarose-embedded samples. Samples are typically removed from agarose before staining and mounted on slides with vacuum grease. Thick agarose sections are best viewed using light microscopy principle instrumentation and applications for high-resolution imaging.
Rozdziały w tym filmie
0:00
Overview
1:05
Fixation of Tissue Samples
4:19
Embedding and Sectioning
6:12
Applications
9:01
Summary