Propagacja fal wapniowych indukowana stymulacją mechaniczną w monowarstwach komórkowych: przykład komórek śródbłonka rogówki bydła

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem kanałów połączeń szczelinowych i kanałów HEMI poprzez ilościowe określenie rozprzestrzeniania się międzykomórkowej fali wapniowej wywołanej stymulacją mechaniczną w monowarstwach pierwotnych komórek śródbłonka rogówki. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie pierwotnych komórek śródbłonka rogówki ze świeżych oczu bydła. W drugim etapie, dwa do trzech dni po wysiewie w szkiełkach komorowych, zlewająca się monowarstwa komórek jest ładowana fluorescencyjnym, wrażliwym na wapń barwnikiem grypy O 4:00 rano. Następnie przykładamy kontrolowany i zlokalizowany bodziec mechaniczny do jednej pojedynczej komórki monowarstwy w celu wywołania międzykomórkowej fali wapniowej, która jest wizualizowana pod mikroskopem konfokalnym.

Wyniki wskazują na rozprzestrzenianie się międzykomórkowej propagacji fali wapniowej. Ostatecznie hamowanie kanałów złączy szczelinowych i kanałów HEMI służy do rozwikłania właściwości i regulacji różnych kanałów Conex i i panex oraz izoform tworzących kanały złączy szczelinowych i kanały HEMI. Główną zaletą propagacji międzykomórkowej fali wapniowej indukowanej stymulacją mechaniczną jest to, że zapewnia prostą i niezawodną metodę badania udziału i właściwości kanałów łączących i ośkujących w sposób nieinwazyjny.

Ponadto metoda opiera się na fizjologicznych cząsteczkach sygnałowych i kaskadach obecnych w badanych układach komórkowych. Wreszcie, można go łatwo dostosować do różnych systemów komórkowych, w tym komórek pierwotnych i modeli komórek, które ektopowo wyrażają pewne połączenia lub izoformy PanIN. Metody te mogą zapewnić wgląd w funkcję i dynamiczną regulację połączeń i kanałów złączy kapu opartych na PanIN oraz kanałów HEMI poprzez zastosowanie pośredniczonego przez SI RNA knockdownu endogennego połączenia lub paniki w izoformach oraz poprzez zastosowanie selektywnych inhibitorów kanałów złączy kapu i kanałów HEMI.

System ten zdecydowanie nie ogranicza się do obu komórek śródbłonka rogówki. Można go dostosować do praktycznie każdego typu komórek, a także do bardziej złożonych tkanek. W tej procedurze wykorzystuje się świeżo wszczepione jądro oka od krowy nie starszej niż 18 miesięcy i nie dłużej niż pięć minut po sekcji zwłok.

Został on przetransportowany do laboratorium w roztworze soli Earl's balance i 1% roztworze jodu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Najpierw przenieś oko na szalkę Petriego o wymiarach 100 milimetrów na 20 milimetrów. Następnie przepłucz oko EBSS zawierającym 1% jodu.

Następnie od tego momentu sterylizuj go roztworem zawierającym 70% etanolu. Praca w sterylnym kapturze. Ostrożnie wypreparuj rogówkę z oka i umieść ją na szalce Petriego o wymiarach 35 milimetrów na 10 milimetrów zawierającej EBSS z warstwą komórek nabłonka skierowaną do góry.

Ostrożnie usuń pozostałą tkankę tęczówki, która nadal jest przyczepiona do rogówki. W razie potrzeby przenieś rogówkę do innego naczynia z EBSS warstwą komórek śródbłonka do góry, a następnie dwukrotnie spłucz EBSS. Następnie umieść rogówkę z warstwą śródbłonka skierowaną do góry w klepsydrze i przykryj pożywką wzrostową.

Aby spłukać, usuń pożywkę za pomocą pipety ssącej. Nałóż 300 mikrolitrów 0,5 grama na litr roztworu tripsin na warstwę śródbłonka rogówki. Umieść klepsydrę zawierającą rogówkę na przykrytej szalce Petriego i przenieś do inkubatora na 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po wyjęciu klepsydry delikatnie zeskrobać komórki śródbłonka z rogówki za pomocą polerowanej ogniowo szklanej pipety pastwiskowej w kształcie haka. Odessać roztwór zawierający komórki śródbłonka i dodać go do kolby hodowlanej o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych zawierającej cztery mililitry pożywki hodowlanej. Następnie nałóż 300 mikrolitrów pożywki wzrostowej na rogówkę.

Powtórzyć skrobanie i dodać roztwór zawierający komórki śródbłonka do kolby hodowlanej. Powtórz ten krok jeszcze raz, a następnie umieść kolby hodowlane zawierające komórki śródbłonka rogówki w pożywce wzrostowej w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Dwa dni później dodaj sześć mililitrów pożywki hodowlanej i odświeżaj pożywkę co drugi dzień.

Komórki powinny zlewać się w ciągu siedmiu do 10 dni od izolacji do przejścia. Najpierw odessać pożywkę hodowlaną, a następnie dwukrotnie spłukać EBSS. Następnie dodaj do komórek dwa mililitry płynów w roztworze i umieść kolbę w inkubatorze na trzy do czterech minut.

Następnie dodaj 12 mililitrów pożywki wzrostowej i trzykrotnie odpipetuj pożywkę do środka i na zewnątrz, aby rozproszyć komórki. Następnie policz komórki za pomocą hemometru, cytometru lub automatycznego licznika komórek. Dodaj 165 000 komórek do dwóch szkiełek hodowlanych.

Następnie przygotować kolby hodowlane o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych do nowego przejścia o gęstości 6 250 komórek na centymetr kwadratowy i dodać świeżą pożywkę hodowlaną do całkowitej objętości 25 mililitrów i umieścić kolby i szkiełka komorowe w inkubatorze. Pożywka jest odświeżana co dwa dni, a płynność warstwy komórkowej powinna zostać osiągnięta w ciągu trzech do czterech dni. Najpierw załaduj komórki w komorze szkiełka z 10 mikromolowymi grypami o 4:00 rano w buforze fosforanowym soli fizjologicznej przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z delikatnym potrząsaniem, podczas gdy komórki wysiadują w grypie o 4:00 AM połącz szklaną mikropipetę o średnicy końcówki mniejszej niż jeden mikrometr z pozycjonerem pio electro crystals nano, i podłączyć do wzmacniacza zamontowanego na mikromanipulatorze.

Ustaw napięcie pozycjonera nano w zakresie od 0,2 do 1,5 wolta. Usuń grypę z roztworu o 4:00 rano. Następnie przemyć komórki pięciokrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, a następnie inkubować komórki z PBS przez co najmniej pięć minut w temperaturze pokojowej przed pomiarem.

Wzbudzone 488 nanometrów za pomocą lasera argonnowego i użyj rozdzielacza wiązki HFT 48. Zbierz emisję fluorescencyjną przy 530 nanometrach za pomocą długoprzepustowego filtra emisyjnego, LP 5 0 5 z otworkiem ustawionym na minimum, tutaj stosuje się obiektyw zanurzeniowy w oleju 40 x. Umieść szkiełko komory na stoliku mikroskopu konfokalnego i znajdź obszar komórek konfluencji.

Następnie przesuń mikromanipulator, aby ustawić szklaną mikropipetę tak, aby dotykała błony komórkowej pod kątem 45 stopni. Uruchom mikromanipulator, aby na krótko dotknąć mniej niż 1% błony pojedynczej komórki szklaną mikropipetą i sprowokować jednosekundową mechaniczną stymulację komórki. Następnie zmierz przestrzenne zmiany stężenia jonów wapnia po stymulacji mechanicznej za pomocą mikroskopu konfokalnego, zbierz i zapisz obrazy.

Na koniec narysuj wielokątny obszar zainteresowania, aby zdefiniować całkowitą powierzchnię reagujących komórek za pomocą oprogramowania mikroskopu konfokalnego. Przejściowe stany przejściowe wapnia wywołane stymulacją mechaniczną są pokazane w różnych punktach czasowych w warunkach kontrolnych w komórkach śródbłonka rogówki bydła za pomocą reprezentatywnych pseudokolorowych obrazów fluorescencyjnych, intensywność fluorescencji przed stymulacją pokazano na pierwszym obrazie. Biała strzałka na drugim obrazie identyfikuje komórkę stymulowaną mechanicznie.

Fala wapniowa rozchodzi się do sześciu sąsiednich warstw komórkowych, a łączna powierzchnia komórek, do których dociera fala, daje obszar aktywny 62 870 mikrometrów kwadratowych. Wykres liniowy pokazuje przebieg w czasie znormalizowanej wartości fluorescencji lub NF w mechanicznie stymulowanej komórce oznaczonej ms oraz średnią wartość NF w sąsiednich warstwach komórek od jednej do pięciu oznaczonych na wykresie jako MB jeden do MB pięć. Obrazy te pokazują znaczące zmiany w rozprzestrzenianiu się międzykomórkowych fal wapniowych po leczeniu egzogennymi nukleotydami na wykresie po lewej stronie i po leczeniu inhibitorami ekto nukleotydów aazy na wykresie po prawej stronie bardziej szczegółowo, wykres po lewej stronie pokazuje znaczny spadek obszaru aktywnego po leczeniu bydlęcych komórek śródbłonka rogówki egzogennym Aras Aase sześć i Aase siedem, który hydrolizował A, TP i A DP, hamując w ten sposób perykrynny szlak komunikacji międzykomórkowej.

Gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,001 w obecności i braku ace. Wykres po prawej stronie pokazuje znaczny wzrost obszaru aktywnego po leczeniu BCEC selektywnym inhibitorem ektonukleotydów, A RL 6 7 1 56, wzmacniając w ten sposób perykrynny szlak komunikacji międzykomórkowej. Gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,001 w obecności i braku RL Po opanowaniu.

Technikę tę można wykonać w ciągu pięciu do 10 minut na jeden eksperyment w jednym stanie, jeśli zostanie przeprowadzony prawidłowo. Wykonanie całej serii eksperymentów, z których można porównać różne warunki, zajmuje jeden dzień, aby wyciągnąć wnioski statystyczne. Należy przeprowadzić niezależne doświadczenia przeprowadzone w różnych dniach i z różnych partii wyizolowanych komórek.

Pomiar i ilościowe określenie wewnątrzkomórkowej propagacji fal wapniowych pozwala na identyfikację i scharakteryzowanie biologicznej regulacji komórki różnych izoform połączeń i ine, takich jak kanały połączeń gab i kanały HEMI. Chciałbym również podkreślić, że ta metoda nie jest samodzielna, ale powinna być uzupełniana innymi podejściami molekularnymi i funkcjonalnymi, począwszy od transferu diety, a skończywszy na uwalnianiu TP i elektrofizjologii.