Mikroskopia przyżyteczna do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych
1 września 2013
Mikroskopia przyżyciowe to potężne narzędzie, które umożliwia obrazowanie różnych procesów biologicznych u żywych zwierząt. W tym artykule przedstawiamy szczegółową metodę obrazowania dynamiki struktur subkomórkowych, takich jak ziarnistości wydzielnicze, w gruczołach ślinowych żywych myszy.
Ogólnym celem tej procedury jest uwidocznienie struktur subkomórkowych w mysich gruczołach ślinowych. Osiąga się to poprzez uprzednie chirurgiczne odsłonięcie gruczołów ślinowych bez ich uszkodzenia. W drugim etapie znieczulone zwierzę jest unieruchamiane na stoliku mikroskopowym.
Następnie gruczoły ślinowe są starannie ustawiane, aby nie zagrozić ich funkcji w ostatnim etapie. Mysz jest stabilizowana za pomocą niestandardowego uchwytu, aby zminimalizować wszelkie artefakty ruchu spowodowane biciem serca lub oddychaniem zwierzęcia. Ostatecznie dynamikę struktur subkomórkowych można zobrazować za pomocą mikroskopii intrażyciowej.
Przed znieczuleniem zważ myszy, aby określić odpowiednią dawkę środka znieczulającego. Następnie wywołaj znieczulenie wstępne przez inhalację fluoru. Gdy zwierzęta stracą przytomność, należy potwierdzić sedację co 15 minut za pomocą trzasku i trzymać myszy pod lampą grzewczą przez cały czas trwania operacji.
Monitoruj temperaturę ciała zwierząt za pomocą termometru z sondą doodbytniczą. Teraz ogol szyję myszy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia, a następnie użyj gąbki z gazy nasączonej etanolem, aby wytrzeć brzuszną stronę szyi, osuszając nadmiar alkoholu chusteczką kim. Następnie użyj pary, zakrzywionych pęset, aby podnieść mały kawałek skóry na dolnym końcu mięśni masytarza i wykonać małe nacięcie.
Włóż nożyczki do nacięcia, kierując końcówki do góry w kierunku spodu skóry i kilkakrotnie otwierając ostrza, aż skóra oddzieli się od leżącej pod spodem tkanki. Następnie zaczynając w pobliżu podstawy gruczołów ślinowych, gdzie przewód nerwowy i naczynia krwionośne łączą gruczoł z resztą ciała. Użyj nożyczek, aby wyciąć pasek luźnej skóry o szerokości trzech milimetrów i długości 10 milimetrów.
Po oczyszczeniu obszaru rany, powstały otwór będzie miał owalny kształt i będzie miał wymiary około ośmiu na 12 milimetrów. Oba gruczoły ślinowe będą widoczne. Użyj strzykawki, aby nałożyć żel sprzęgający optyczny na środek cięcia, a następnie użyj świeżych kawałków sterylnej gazy, aby wytrzeć żel w kierunku zewnętrznej strony otworu, aż cała krew i luźne włosy zostaną usunięte.
Teraz użyj pęsety numer siedem, aby znaleźć końcówkę prawego gruczołu ślinowego, chwytając tkankę łączną kilka milimetrów powyżej górnej części gruczołu. Następnie rozerwij tkankę łączną wokół gruczołu, nie uszkadzając miąższu. Po odsłonięciu gruczołu delikatnie oddziel tkankę łączną od gruczołu, zmywając krwawienie solą fizjologiczną.
Upewnij się, że wszystkie tkanki łączne są oddzielone, a gruczoł jest całkowicie odsłonięty. Przed przyniesieniem zwierzęcia do mikroskopu umieść gruby kawałek gazy i okład grzewczy na stoliku mikroskopu, przykrywając również górną część opakowania cienką gazą. Umieść szkiełko nakrywkowe na środku stołu montażowego.
Następnie ustaw mysz na prawym boku na gazie, zabezpieczając zwierzę kawałkiem taśmy maskującej po brzusznej stronie przedniej prawej łapy i jedwabnym szwem zaczepionym wokół siekaczy. Stwórz pewne napięcie między nicią a łapą i przymocuj je do sceny. Przy większej ilości taśmy maskującej gruczoł ślinowy powinien odpoczywać naturalnie.
W środku szkiełka nakrywkowego. Użyj plastikowych klinów połączonych ze stolikiem mikroskopu, aby dodatkowo ustabilizować głowę i klatkę piersiową myszy. Następnie umieść mały kawałek chusteczki do czyszczenia soczewek na gruczole.
Lekko rozciągnij dławik i umieść niestandardowy uchwyt na dławiku. Następnie mocno przymocuj stabilizator do sceny za pomocą metalowego zacisku i taśmy maskującej. Przykryj zwierzę gazą i poduszką grzewczą i monitoruj temperaturę odsłoniętych gruczołów za pomocą elastycznego termometru wyposażonego w sondę termiczną Natychmiast po ustabilizowaniu zwierzęcia użyj oświetlenia fluorescencyjnego epi, aby skupić się na powierzchni gruczołu.
Oceń przepływ krwi w naczyniach włosowatych i ogólną morfologię tkanki. Aby wzbudzić gen GFP, użyj lasera o długości fali 488 nanometrów. Ustaw moc szczytową na 0,5 miliwata, aby uniknąć fotowybielania białka pomidora tandemowego.
Użyj lasera o długości fali 561 nm, ustawiając moc szczytową na jeden miliwat. Teraz oceń stabilność tkanki, wstępnie skanując wybrany obszar. Jeśli preparat nie jest stabilny, odpowiednio wyreguluj zwierzę, aby znaleźć odpowiednią płaszczyznę ogniskowej.
W trybie wstępnym. Stopniowo przesuwaj obiektyw w kierunku szkiełka nakrywkowego, aż struktury aserowe, granulki wydzielnicze i błona plazmatyczna staną się wyraźnie widoczne. Następnie, aby zobrazować dynamikę granulek wydzielniczych, użyj prędkości skanowania od 0,5 do dwóch sekund na klatkę i 256 na 256 pikseli ze skalą przestrzenną 0,2 mikrometra na piksel.
Aby optymalnie uwidocznić granulki i błonę plazmatyczną, należy ustawić grubość optyczną w zakresie od 0,9 do 1,2 mikrometra. Następnie zapisz obraz pola widzenia, który ma być używany jako punkt odniesienia. Na koniec stymuluj egzocytozę, wstrzykując podskórnie 0,1 miligrama na kilogram świeżo przygotowanego izoproterenolu i soli fizjologicznej.
Jedna minuta po wstrzyknięciu. Fuzja granulek wydzielniczych z błoną plazmatyczną zostanie wykryta przez wzrost fluorescencji GFP wokół granulek i dyfuzję tandemowego peptydu pomidorowego do ich błon ograniczających. U myszy pomidorowej z GFPM azynina pojawia się jako wyraźnie wyraźne struktury, które wyrażają cytozolowy GFP i ukierunkowany na błonę tandemowy peptyd pomidorowy, jak wskazują przerywane linie.
W poszczególnych aser komórki są wyznaczone przez tandemowy peptyd pomidorowy, jak wskazano strzałkami. GFP wykrywa się również w jądrach, które są wyraźnie widoczne wewnątrz komórek aser. Cytozolowy GFP wskazywany przez grot strzałki jest wykluczony z granulek wydzielniczych, które pojawiają się jako ciemne okrągłe pęcherzyki o średnicy około jednego do 1,5 mikrometra.
Aby uwidocznić zdarzenia egzofityczne, po wstrzyknięciu izoproterenolu pokazano reprezentatywny obszar błony plazmatycznej, który jest wzbogacony w granulki wydzielnicze, jak wskazano gwiazdką. Można zaobserwować wzrost poziomu fluorescencji GFP oznaczony zielonymi strzałkami wokół niektórych granulek wydzielniczych, które znajdują się w bliskiej odległości od błony komórkowej. Ponadto, po fuzji z błoną plazmatyczną, tandemowy peptyd pomidorowy dyfunduje do błon ograniczających granulek wydzielniczych, jak zaznaczono czerwonymi strzałkami.
Po 30 do 40 sekundach granulki sekretarki stopniowo się zapadają, a ich błony ograniczające są integrowane z wierzchołkową błoną plazmatyczną. Zaprezentowane tutaj podejście stanowi duży przełom w biologii komórki, ponieważ umożliwia obrazowanie dynamiki specyficznego procesu transportu błonowego u żywych myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółową metodę wizualizacji struktur wewnątrzkomórkowych w śliniankach myszy z wykorzystaniem mikroskopii intravitalnej. Procedura obejmuje chirurgiczne odsłonięcie gruczołów, unieruchomienie zwierzęcia oraz precyzyjne ustawienie w celu zminimalizowania artefaktów ruchowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Mikroskopia intravitalna umożliwia obrazowanie procesów biologicznych w czasie rzeczywistym.
- Jest ona szczególnie użyteczna w badaniu dynamicznych struktur komórkowych.
- Gruczoły ślinowe służą jako model do obserwacji dynamiki subkomórkowej.
- Zrozumienie tej dynamiki może dostarczyć wiedzy na temat różnych procesów fizjologicznych.
Cel badania
- W celu wizualizacji dynamiki struktur podkomórkowych u żywych myszy.
- W celu opracowania wiarygodnej metody obrazowania ziarnistości wydzielniczych.
- W celu pogłębienia zrozumienia funkcji komórkowych w gruczołach ślinowych.
Zastosowane metody
- Chirurgiczne odsłonięcie ślinianek bez powodowania uszkodzeń.
- Unieruchomienie znieczulonego zwierzęcia na stoliku mikroskopu.
- Staranne ustawienie ślinianek w celu zachowania ich funkcji.
- Zastosowanie specjalnego uchwytu do stabilizacji myszy i redukcji artefaktów ruchowych.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie struktur podkomórkowych w żywych śliniankach.
- Wykazanie dynamiki ziarnistości wydzielniczych.
- Walidacja metody do przyszłych badań w żywych modelach zwierzęcych.
- Wgląd w role fizjologiczne tych struktur.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia solidne podejście do badania dynamiki subkomórkowej.
- Mikroskopia intravitalna może być zastosowana w różnych obszarach badań biologicznych.
- Technika ta pogłębia naszą wiedzę na temat procesów komórkowych in vivo.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikroskopia intravitalna umożliwia wizualizację dynamiki podkomórkowej w czasie rzeczywistym w żywych modelach zwierzęcych, dostarczając kluczowych informacji mechanistycznych niezbędnych do walidacji celów i analizy szlaków sygnałowych. Poprzez obrazowanie egzocytozy ziarnistości wydzielniczych oraz transportu błonowego w śliniankach, metoda ta wspomaga przedkliniczną redukcję ryzyka w badaniach nad szlakami sygnalizacyjnymi zależnymi od GPCR, które są istotne dla celów terapeutycznych w chorobach metabolicznych i wydzielniczych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną na wczesnym etapie odkrywania leków, łącząc perturbacje molekularne z funkcjonalnymi efektami podkomórkowymi w fizjologicznie istotnym kontekście.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia bezpośrednią obserwację fuzji ziarnistości wydzielniczych stymulowanej przez receptory beta-adrenergiczne, co wspiera walidację funkcjonalną celów GPCR w żywej tkance.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną platformę do badania regulatorów egzocytozy w postaci kinaz, fosfataz lub elementów cytoszkieletu z wykorzystaniem fluorescencyjnych biosensorów.
- Wartość terapeutyczna: Ułatwia mechanistyczną ocenę ryzyka związków celujących w szlaki cAMP/PKA poprzez ilościowe określanie kinetyki translokacji subkomórkowej w czasie rzeczywistym.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Stabilizowany preparat ślinianki umożliwia spójne obrazowanie sygnałów GFP i tandem-Tomato w stanie wyjściowym na potrzeby przesiewowych badań biblioteki związków.
- Wyniki ilościowe: Umożliwia pomiar częstotliwości fuzji granulek, szybkości dyfuzji błony oraz kinetyki zapadania się jako funkcjonalne odczyty modulacji szlaku.
- Skalowalność: Procedura chirurgicznej stabilizacji i obrazowania może zostać dostosowana do badań na wielu zwierzętach z ustandaryzowaną kontrolą temperatury i ruchu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście chorób: Modeluje regulowaną sekrecję w tkankach egzokrynnych, co znajduje zastosowanie w badaniach nad zapaleniem trzustki, zespołem Sjögrena lub dysfunkcją regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR).
- Ciągłość biomarkerów: Fluorescencyjne reportery błon ziarnistych i cytozolu umożliwiają korelację wyników obrazowania z biochemicznymi analizami sekrecji.
- Przedkliniczna redukcja ryzyka: Wspiera decyzje typu „go/no-go” poprzez powiązanie oddziaływania na cel z funkcjonalnymi skutkami wewnątrzkomórkowymi przed fenotypowaniem na poziomie narządu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego, w którym obrazowanie subkomórkowe w czasie rzeczywistym dostarcza informacji o mechanizmie działania oraz selektywności szlaku.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków efektorowych GPCR poprzez wizualizację rekrutacji efektorów w dół kaskady oraz dynamiki błon w nienaruszonym tkance.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie preparatów do analiz w celu oceny wpływu związków na kinetykę egzocytozy z rozdzielczością przestrzenną i czasową.
- Analityka: Generuje ilościowe dane dotyczące zmian intensywności fluorescencji, szybkości dyfuzji oraz czasu zapadania się pęcherzyków w celu porównania warunków doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Łączy celowanie molekularne z funkcjonalnym wydzielaniem w modelu egzokrynnym istotnym dla danej choroby, wspierając ekstrapolację do ludzkiej patofizjologii.
- Ponowne zastosowanie w przedsiębiorstwie: Platformę stabilizacji i obrazowania można ponownie wykorzystać dla wielu reporterów fluorescencyjnych i modeli chorób przy minimalnej rewalidacji.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w transdukcji sygnału poprzez zapewnienie bezpośredniej wizualizacji zdarzeń translokacji efektorów oraz ich integracji z błoną.
- Wartość operacyjna: Standaryzowany protokół immobilizacji i obrazowania poprawia powtarzalność wyników między laboratoriami oraz w ramach różnych ram czasowych badań.
- Wartość strategiczna: Umożliwia wcześniejszą identyfikację wyników fałszywie dodatnich poprzez potwierdzenie funkcjonalnej aktywności wewnątrzkomórkowej wykraczającej poza wiązanie lub masowe analizy biochemiczne.
- Wpływ na portfolio: Zwiększa pewność w wyborze celu poprzez walidację zaangażowania szlaku w fizjologicznie nienaruszonym, dynamicznym środowisku komórkowym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w przeprowadzaniu operacji na myszach, znieczulaniu oraz konfiguracji mikroskopii intravitalnej.
- Metoda jest zależna od mikroskopu konfokalnego z liniami laserowymi 488 nm i 561 nm, platformy termicznej oraz sprzętu do stabilizacji ruchu.
- Niezbędne są standaryzowane protokoły przygotowania zwierząt, aby zapewnić dostęp do gruczołu oraz stabilność funkcjonalną w kolejnych eksperymentach.
- Adaptacja do innych tkanek może wymagać zmodyfikowanych podejść do stabilizacji ze względu na różnice w ruchomości i dostępności organów.
- Ograniczenia wynikające z fotobleachingu wymagają starnej kalibracji mocy lasera oraz odpowiedniego doboru częstotliwości klatek dla obrazowania podłużnego.
