Zoptymalizowane protokoły zarządzania szczepem Mycobacterium leprae: konserwacja i konserwacja zamrożonych stad u nagich myszy Athymic

Celem niniejszej pracy jest pokazanie, w jaki sposób można przygotować wysoce żywotną zawiesinę lipidową prątków. Do nagich myszy. Zachowamy żywotność basów z zainfekowanej myszy, najlepiej we wczesnej fazie infekcji.

Aby zagwarantować wysoką żywotność plonów, należy poddać zwierzę eutanazji w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przytrzymaj tylny impuls za pomocą kleszczy hemostatycznych. Odetnij je z drgawkami i zanurz w 2% jodu na 20 minut W celu odkażenia przytrzymaj pozycję punktową z podkładką pod stopy skierowaną do góry.

Zbierz tkankę miękką Za pomocą ostrza skalpela usuń kości pierwszego i piątego paliczka, aby ułatwić homogenizację tkanki. Umieść tkankę na sterylnej szalce Petriego. Zeskrob naskórek.

Pokrój tkankę ziarniniakową na małe kawałki nożyczkami i poczekaj na późniejsze obliczenia programu uzysku tkanki. Przenieś małe kawałki do probówki zawierającej jeden ml zbilansowanego roztworu soli Hanka. Dodaj jeden dodatkowy ml motka i homogenizuj tkankę trzy razy przez 15 sekund za każdym razem z prędkością. Cztery.

Umieść sitko do komórek w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Odpipetować zawiesinę na sitko i pozwolić, aby roztwór przeszedł grawitacyjnie. Aby wyeliminować zanieczyszczenia, dodaj jeszcze dwa MLS motków do zawieszenia i ponownie je homogenizuj.

Korzystając z tego samego cyklu, przepuść zawiesinę przez to sitko. Obraca sitko, dodając motki. Aby zmniejszyć całkowitą objętość zawiesiny do dziewięciu ml, należy dodać jeden ml 0,5% roztworu trysyny do zawiesiny, aby uzyskać końcowe stężenie 0,05%.

Wymieszaj, delikatnie odwracając probówkę inkubowaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut. Po inkubacji doprowadzić objętość zawiesiny do czterech MLS, dodając sterylną wirówkę do soli fizjologicznej o sile 1700 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, wyrzucić supernat i ponownie zawiesić paletę, stukając w probówkę. Dodaj jeden ml soli solnej surowiczej i wymieszaj.

Przenieś zawieszenie do nowej dętki. Homogenizować zawiesinę naczyniową za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności jednego ml z igłą o rozmiarze 26, przenosząc zawiesinę do nowej probówki. Przeprowadzić kontrolę mikrobiologiczną zawiesiny, umieszczając dwie krople 18 pożywki, siedem H dziewięć infuzji serca mózgu.

11 Stein Genesen inkubował w temperaturze 37 stopni Celsjusza. A następnie postępuj zgodnie z rutynowymi procedurami kontroli mikrobiologicznej. Do barwienia kodem Z.

Przygotuj jeden do 10 i jeden do stu. Rozcieńczenie zawiesiny S w roztworze soli fizjologicznej. Homogenizować każde rozcieńczenie przed przygotowaniem tych świateł do liczenia, przygotować trzy szkiełka, rysując trzy okręgi o średnicy wewnętrznej 10 milimetrów na powierzchni każdego szkiełka za pomocą trwałego markera atramentowego.

Teraz otocz kręgi pisakiem immunohistochemicznym. Oznacz te światła za pomocą ołówka numer dwa, który przygotowuje światła dla trzech stężeń sary. Nierozcieńczony jeden do 10 i jeden do stu.

Odpipetować pięć mikrolitrów roztworu surowicy fenolowej i 10 mikrolitrów zawiesiny sary w każdym okręgu, homogenizować i równomiernie rozprowadzać zawiesinę na całym obszarze koła. Za pomocą uchwytu jednorazowej pętli umieść te lampki na równym stole do wyschnięcia po wyschnięciu. Napraw je, przesuwając te światła trzy razy nad niebieskim płomieniem z zawieszeniami kawalerskimi skierowanymi do góry.

Wykonaj kod podtrzymujący Zuni. Przyjrzyj się tym slajdom. Trzy rozcieńczenia.

Wybierz najbardziej odpowiednie rozcieńczenie do liczenia sary. Przygotować 200 mikrolitrów zabitej zawiesiny sary przez autoklawowanie zawiesiny naczyniowej przez 30 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza. Użyj zestawu żywotności bakterii L 7 0 0 7 Live dead back light do fluorescencyjnego barwienia lipidów mikrobakteryjnych.

Przygotuj 10 rozcieńczeń roztworu A i od jednego do 20 rozcieńczeń roztworu B. Bezpośrednio przed użyciem. Do każdych 200 mikrolitrów nierozcieńczonej zawiesiny naczyniowej oryginalnej i zabitej dodać 3,6 mikrolitra rozcieńczonego roztworu A i sześć mikrolitrów rozcieńczonego roztworu B. Po 15 minutach inkubacji w ciemności wycisz zawiesinę o stężeniu 10,600 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń super natin za pomocą pipety reus.

Zawiesić granulat w 50 mikrolitrach 10% glicerolu, homogenizować go, pipetując w górę iw dół. Umieścić osiem mikrolitrów każdej zawiesiny na szkiełku podstawowym i przykryć małym szkiełkiem nakrywkowym. Chroni go przed światłem.

Obserwuj zawiesiny pod mikroskopem fluorescencyjnym. Przygotować zawiesinę o stężeniu od 10 do siedmiu warg BA na ml, qu jeden ml pożywki zamrażającej w każdej fiolce kriogenicznej. Następnie dodać 150 mikrolitrów zawiesiny S do jednego ml pożywki zamrażającej i homogenizować ją przez odwrócenie probówki.

Umieścić fiolkę kriogeniczną w pojemniku do zamrażania. Utrzymuj pojemnik w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny. Przenieś probówki do pudełka do przechowywania i utrzymuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do rozmrożenia.

Zamrożoną zawiesinę rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieść zawiesinę do probówki stożkowej zawierającej 20 mil sterylnego centa soli fizjologicznej. Odmówił koncentracji.

Bazina była zgodna z protokołem podtrzymującym Z do liczenia i protokołem barwienia fluorescencyjnego do określania zmienności. Przygotować zawiesinę zawierającą od 10 do ośmiu BA na posiłek, homogenizować zawiesinę przed zaszczepieniem każdego zwierzęcia. Pobrać sto mikrolitrów do strzykawki insulinowej i zaszczepić 30 mikrolitrów w tylnych opuszkach stóp każdego zwierzęcia w celu określenia żywotności.

Zielona fluorescencja jest obserwowana we wszystkich BAI, a czerwona fluorescencja tylko w tym bai. Gdy BAI jest kontrolowany ze stali nierdzewnej, obserwuje się tę samą intensywność zielonego i czerwonego światła BAI. Inokulacja M Lepar zamrożonego przez różne okresy daje od 10 do 1000 razy większą liczbę BAI odzyskanych po siedmiu miesiącach.

Na zakończenie chcielibyśmy dodać, że ponieważ IL leid nie rośnie in vitro, protokół ten pozwala na szybki i łatwy sposób utrzymania żywotności yl Leid dostępnej do dalszych zastosowań w laboratorium.