Zaawansowane podejścia genetyczne w Chlamydia trachomatis

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie analizy genetycznej chlamydii tritus poprzez przeprowadzenie mutagenezy chemicznej i określenie powiązań fenotypu genotypu. Osiąga się to poprzez wytworzenie najpierw zmutowanych szczepów chlamydia tracom za pomocą mutagenezy chemicznej. Następnie wszystkie mutacje generowane przez substancje chemiczne są identyfikowane przez sekwencjonowanie całego genomu, a następnie składanie genomu sterowanego referencyjnie.

Następnie identyfikowane są powiązania fenotypu genotypu w zmutowanych szczepach. Wreszcie, powiązania genotypów fenotypowych są potwierdzane poprzez generowanie rekombinowanych szczepów i ich analizę. Ostatecznie można uzyskać wyniki pokazujące, że mutacja w konkretnym genie chlamydii prowadzi do fenotypu będącego przedmiotem zainteresowania dzięki połączeniu klasycznych podejść do mutagenezy chemicznej i nowej generacji Singha.

Obecnie nie ma dostępnych metod zastępowania genów w chlamydii, a molekularne narzędzia genetyczne do jej badania są w powijakach. Metoda ta nie wymaga transformacji za pomocą rekombinowanego DNA ani opracowywania narzędzi genetyki molekularnej, a mimo to osiąga ten sam cel. Jest to przypisanie funkcji poszczególnym produktom genowym.

Aby przygotować hodowane komórki, siedź około 10 razy na sześć komórek vir na 25 centymetrów kwadratowych w trzech mililitrach DMEM uzupełnionych 10% FBS, inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Gdy komórki osiągną zbieżność około 24 godziny później, odessać pożywkę i zainfekować komórki chlamydią przy wielokrotności infekcji wynoszącej pięć. W łącznej objętości trzech mililitrów D-M-E-M-F-B-S zawierającej 200 nanogramów na mililitr cykloheksymidu, aby rozpocząć mutagenezę po 18 godzinach od zakażenia pod kapturem chemicznym, przygotuj 20 miligramów na mililitr sulfonianu etylometanu lub EMS w PBS z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu.

EMS jest silnym mutagenem i czynnikiem rakotwórczym. W związku z tym należy zapoznać się z protokołem tekstowym w celu jego usunięcia. Odessać pożywkę z komórek Vero i przemyć je raz trzema mililitrami PBS z chlorkiem magnezu i chlorkiem wapnia.

Następnie w trzech mililitrach roztworu EMS i inkubować przez godzinę w dygestoriach w temperaturze pokojowej. Po inkubacji należy usunąć EMS i umieścić go w pojemniku zawierającym jeden molowy wodorotlenek sodu w celu dezaktywacji mutagenu przed trzykrotnym przemyciem komórek w celu usunięcia wszelkich pozostałości EMS. Następnie w sześciu mililitrach DMEM 10% FBS z 200 nanogramami na mililitr cyclo heide i 25 mikrogramami na mililitr gentamycyny i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 do 72 godzin.

Inkluzje wydają się pozbawione bakterii po około 36 godzinach od mutagenezy po 72 godzinach. Około 10% inkluzji jest wypełnionych bakteriami, podczas gdy reszta pozostaje pusta, aby wyekstrahować ciała elementarne lub EBS przez hipotoniczną lizę, całkowicie zasysać pożywkę. Dodaj jeden mililitr wody i miażdż przez 10 minut, aby usunąć komórki, przetrzyj komórki, pipetując w górę iw dół co najmniej 10 razy.

Po zebraniu lizatu w mikro probówce fuge, dodaj 0,25 mililitra pięciu x sacharozy, buforu glutaminianu fosforanowego lub SPG do jednego x końcowego stężenia i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Ustaw zlewające się monowarstwy komórek ves w sześciu płytkach dołkowych, wysiewając około 0,4 razy 10 z sześciu komórek w trzech mililitrach DMEM 10% FBS na dołek, co pozwoli komórkom utworzyć jednorodną monowarstwę w ciągu następnych 24 godzin. Następny upadek na lód, podstawowy roztwór mutagenu chlamydii.

Następnie przygotuj sześć probówek dziesięciokrotnego seryjnego rozcieńczenia w całkowitej objętości 200 mikrolitrów na rozcieńczenie w DMEM 10% FBS i umieść je na lodzie. Użyj trzech mililitrów na studzienkę PBS, aby dwukrotnie umyć komórki Vero. Następnie dodaj trzy mililitry DMEM do każdej studzienki na sześć płytek dołkowych i 100 mikrolitrów rozcieńczenia bakteryjnego w dwóch egzemplarzach.

Zakręć płytką, aby zapewnić równomierną mieszanie. Obracaj zainfekowane płytki w temperaturze 2 700 GS przez 30 minut w temperaturze 15 stopni Celsjusza. Następnie inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla przez jedną do dwóch godzin.

W międzyczasie przygotuj 0,54% AROS w DMEM, najpierw łącząc następujące składniki i mieszając. Następnie wymieszaj 18,9 mililitra gorącego sterylnego, 1,2% aros z wodą, mieszając, aby zapobiec grudkom. Utrzymuj mieszaninę w cieple w łaźni wodnej o temperaturze 55 stopni Celsjusza.

Odessać zawiesinę bakteryjną z naczyń i dodać sześć mililitrów ciepłego roztworu aro. Pozwól mu całkowicie zestalić się w temperaturze pokojowej na zewnątrz okapu. Następnie w kapturze bezpieczeństwa biologicznego ze zdjętymi pokrywkami suszyć płytki przez dodatkowe 15 minut, gdy płytki wyschną, inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla przez siedem do 10 dni.

Blaszki powinny być widoczne za pomocą mikroskopu preparacyjnego na dzień przed wyizolowaniem mutantów. Zobacz jeden razy 10 do czterech komórek zerowych w 100 mikrolitrach na studzienkę. W 96-dołkowej płytce komórki będą się zlewać w ciągu 24 godzin.

Pod mikroskopem preparacyjnym zaznacz płytki do pobrania, a następnie użyj sterylnej pipety barierowej o pojemności jednego mililitra, aby zebrać zatyczki blaszek. Resus zawiesić płytki w 100 mikrolitrach DMEM uzupełnionym 10% FBS 400 nanogramów na mililitr, cyklo, heide i 50 mikrogramów na mililitr. Gentamycyna w celu rozprężenia zmutowanych szczepów nakłada zawiesinę na zbiegające się monowarstwy komórek Vero.

Wiruj płytki w temperaturze 2, 700 GS i 15 stopni Celsjusza przez 30 minut przed inkubacją zbiorów, gdy zakażonych jest więcej niż 50% komórek, co może nastąpić już po 48 godzinach od zakażenia i dopiero po 14 dniach. Ta ilość zakażonych komórek pozwala na przechowywanie wystarczającej ilości żywotnych bakterii w celu ekstrakcji EV poprzez hipotoniczną lizę zakażonych komórek. Po zassaniu pożywki w 160 mikrolitrach sterylnej wody i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Użyj końcówek barierowych, aby rozbić komórki, pipetując kilka razy w górę iw dół, aby zapewnić całkowitą lizę. Na koniec przenieś 160 mikrolitrów każdego lizatu do probówek z mikrofugami. Dodaj 40 mikrolitrów pięciu XSPG i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do oznaczenia i badania przesiewowego mutantów pod kątem interesujących nas fenotypów.

Narażenie na mutagen prowadzi do inkluzji, które wydają się pozbawione bakterii, prawdopodobnie z powodu śmierci komórek bakteryjnych. Zazwyczaj serowar LGVL 2 całkowicie zniszczy zakażone komórki w ciągu 48 godzin po zakażeniu, ale leczenie mutagenami może wydłużyć ten cykl do ponad 90 godzin, a w naszych eksperymentach oczekuje się, że około 10% inkluzji wyzdrowieje. Zakażone komórki Vero leczone 20 miligramami na mililitr EMS doprowadziły do 99% spadku odzyskiwania zakaźnego potomstwa w porównaniu z nieleczonymi kontrolami, jak widać na tym rysunku.

Leczenie mutagenów doprowadziło również do pojawienia się blaszek o zmienionej morfologii, w tym małych blaszek. Inne morfologie obejmują blaszki, które wydają się ziarniste, grudkowate lub w kształcie plastra miodu, jak pokazano tutaj. Dawki EMS stosowane w tych badaniach mogą prowadzić do od trzech do 30 mutacji na genom KCL, zgodnie z oceną eksperymentalną za pomocą NGS.

Chociaż oczyszczone gradientowo EBS są w dużej mierze wolne od materiału komórkowego gospodarza, wykrywa się również DNA gospodarza i stanowi około 10 do 15% preparatów genomowych Po tej procedurze. Badania przesiewowe pod kątem fenotypów, takich jak upośledzona replikacja w komórkach hodowli tkankowej, utrata aktywności biochemicznej lub zmiana morfologii bakterii, mogą być przeprowadzone w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak czynniki bakteryjne, które są wymagane do powstania i utrzymania chlamydii, czynniki chorobotwórcze.