Nanobiopolimery na bazie kwasu polimalowego do celowania w wiele markerów nowotworowych: szansa dla medycyny spersonalizowanej?

Ogólnym celem jest stworzenie platformy w nanoskali, otwartej na uniwersalny protokół syntezy medycyny spersonalizowanej na podstawie genetycznego wyposażenia danej choroby, zwłaszcza w przypadku raka. Najpierw wyprodukuj i oczyść kwas polijabłkowy z mikroorganizmu frum polycephalum, chemicznie aktywuj oczyszczony PMLA na jego wisiorku. Grupy karboksylowe przyłączają małe grupy funkcyjne i łącznik MEA poprzez podstawienie grup aktywowanych i przywracają niewykorzystane grupy aktywowane do grup karboksylowych przez hydrolizę.

Następnie dodaj przeciwciała i cząsteczki antysensu przez grupy wodne siarki przekładki, MEA i czapeczki. Niewykorzystana przekładka w reakcji z PDP po zakończeniu przetestuj skład i funkcję przewodu. Nanolek powstaje na modelu zwierzęcym, takim jak myszy przenoszące agresywnego człowieka.

Dwie dodatnie wyniki raka piersi mogą decydować o skuteczności leczenia, a także o tym, czy leczenie przebiega bez niepożądanych skutków ubocznych. Główną przewagą bioprodukcji nad istniejącymi metodami syntetycznymi, takimi jak polimeryzacja opingowa, jest to, że biopolimer zachowuje pełną czystość optyczną i nie jest zanieczyszczony produktami ubocznymi. Ta rodzina nanoleków PolyPhen może celować w dowolny typ komórek w oparciu o określone ukierunkowanie i regulować ekspresję białek.

Ogólnie rzecz biorąc, leczenie raka za pomocą nanoleków PHE jest bardzo skuteczne w kilku modelach zwierzęcych, przebijając pierwotne nowotwory mózgu i piersi. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł, aby ta metoda blokowała syntezę kulawizny specyficznej dla glejaka w postaciach isof, a później udowodniliśmy, że celowanie w hamowanie HER dwu- i potrójnie ujemnych białek raka piersi zapobiega wzrostowi guza. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnostyki raka za pomocą rezonansu optycznego i magnetycznego.

Polinanoleki mogą zapewnić wgląd w dostarczanie leków w leczeniu raka. Może być również stosowany w innych stanach patologicznych, takich jak choroby zakaźne, łagodzenie bólu i zaburzenia neurologiczne. Po wyhodowaniu kultury zarodźca nasiennego ze spialu na ślimaku zaszczepij 100 mililitrów podstawowej pożywki hodowlanej i hoduj kulturę w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Inkubator z termosem wytwarza pewną ilość grawitacyjnie wypełnionych modiów mikroplazmowych pod wykluczeniem światła. Aby uniknąć zarodnikowania w 10-litrowym naczyniu bioreaktora, rozpuść 80 gramów węglanu wapnia w ośmiu litrach podłoża podstawowego, a następnie przenieś modia mikroplazmy paktu do zamontowanego naczynia reakcyjnego i ustaw bioproces na 75 godzin. W temperaturze 25 stopni Celsjusza przy przepływie przefiltrowanego powietrza o natężeniu 10 litrów na minutę i prędkości 150 obr./min, mieszaniu za pomocą mieszania segmentowego.

Gdy bulion hodowlany ma pH 4,8, zatrzymaj hodowlę, aby zmierzyć produkcję kwasu polimaleinowego. Teraz schłodzić bulion do 17 stopni Celsjusza i pozwolić komórkom osiąść grawitacyjnie i usunąć supernatant hodowli z reaktora. Dostosuj pH do 7,5.

Teraz przepompuj supernatant od dołu przez 1,5-litrową kolumnę celulozową DEAE zrównoważoną 20-milimolowym chlorowodorkiem tris o pH 7,5 w temperaturze pięciu stopni Celsjusza. Następnie przepuścić trzy kolumny buforu płuczącego zawierającego 0,3 molowy chlorek sodu od dołu do góry kolumny, wymyć PMLA w obecności 0,7 molowego chlorku sodu. Dostosuj frakcję wymykającą się PMLA do 0,1 molowego chlorku wapnia i dodaj 80% lodowatego etanolu, aby wytrącić wapń PMLA następny rozmiar frakcjonowanego, wapń PMLA za pomocą cidex G 25 i wody.

Na koniec przepuść każdą frakcję przez bursztynową kolumnę światła i natychmiast zamroź przepływ przez kwas polijabłkowy w ciekłym azocie i liofilizuj przed przechowywaniem w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby aktywować grupy karboksylowe PMLA, zmieszaj jedną milimolową jednostkę P-M-L-A-H w jednym mililitrze bezwodnego acetonu i jednym milimolu, każdy z hydroksy CIN aide i cylo heyl carbo ide w dwóch mililitrach dimetyloformamidu po mieszaniu w 20 stopniach Celsjusza przez trzy godziny, dodaj 0,05. Milimole metylu Pega oznaczają jeden mililitr DMF, a następnie 0,05 milimoli trietyloaminy.

Następnie kroplami dodać 0,4 milimola estru etylowego leucyny i po godzinie sprawdzić, czy reakcja została zakończona przez ujemną odpowiedź hyn na chromatografii cienkowarstwowej. Podobnie dodaj 0,1 milimola dwóch me capto, jednego etyloaminy i 0,5 milimoli herbaty. Usuń resztki estru NHS przez spontaniczną hydrolizę z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami.

Odsolić w kolumnie PD 10 i liofilizować w celu uzyskania białego proszku, przechowywać ten wstępnie sprzężony w suchym miejscu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 30 miligramów przeciwciała w 4,5 mililitra 150-milimolowego chlorku sodu w 100-milimolowym fosforanie sodu o pH 5,5. Zredukuj wiązania siarczkowe za pomocą pięciu milimolowych tris, dwóch chlorowodorków fosfiny karboksylowo-etylowej i oczyść nad kolumną PD 10.

Teraz rozpuść IDE PEG IDE w dwóch mililitrach powyższego buforu, aczkolwiek przy pH 6,3. Dodaj zredukowane przeciwciało i mieszaj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez godzinę. Skoncentruj do 2,5 mililitra nad AVEVA spin 20 z wykluczeniem 30 kilodaltonów, a następnie oczyść nad cidexem G 75.

Teraz sprawdź produkt przez SEC HPLC. Zmierz ilość przy 280 nanometrach, a także potwierdź brak zanieczyszczeń na innych długościach fal. Następnie wymieszaj 50 miligramów prekoniugatu z 200 MLE sprzężonego z przeciwciałem PEG IDE w pięciu mililitrach buforu o pH 6,3.

Dostosuj stężenie siarki wodnej do dwóch milimoli i inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Aby uzyskać rozpuszczalność 98%, trzy oligonukleotydy z pierwotnymi antysensownymi aminami reagują z jedną objętością SPDP, oczyszczają A-O-N-P-D-P nad cidexem LH 20 w metanolu, a następnie odparowują metanol, rozpuszczają produkt w wodzie i liofilizują teraz inkubować 800 zwierząt nan aktywowanego aos z przeciwciałem PEG wstępnie sprzężonym z MEA SH przez noc. Po zakończeniu reakcji wymiany siarczku diss, należy włączyć fluorescencyjny blok barwnika, nadmiar siarki hydros z PDP i oczyścić z cidexu G 75.

Przechowuj końcowy nanolek na bazie kwasu polijabłkowego w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby oszacować zawartość kwasu polimaleinowego podczas produkcji, postępuj w następujący sposób, do 320 mikrolitrów próbki dodaj 160 mikrolitrów 10% chlorku hydroksylowo-amonowego i 160 mikrolitrów 10% wodorotlenku sodu. Po 10 do 15 minutach wymieszaj ze 160 mikrolitrami 5% roztworu chlorku żelaza i wizualizuj tworzenie się ciemnofioletowego koloru przy 540 nanometrach. Następnie hydrolizuj nanolek przez noc w dwumolowym kwasie solnym w temperaturze 110 stopni Celsjusza, używając szczelnie zamkniętego testu ampułkowego na kwas maleinowy metodą odwróconej chromatografii fazowej.

Używanie próbek wzbogaconych wzorcami kwasu maleinowego. Teraz rozszczep nanolek za pomocą 100-milimolowego dihi three etol i zmierz oligonukleotydy antysensowne morfologiczne za pomocą ilościowej HPLC z odwróconą fazą w stosunku do standardów morpho a ON. Za pomocą rozszczepionego nanoleku zmierz zawartość przeciwciał za pomocą zestawu do oznaczania białek w celu ilościowego określenia zawartości Malik PEG.

Najpierw reaguj z tiocyjanianem amonu OT, a następnie ekstrahuj chloroformem i zmierz absorbancję przy 510 nanometrach. Przetestuj aktywność przeciwciał i koligację przez Elizę przy użyciu pięciu mikrolitrów nanoleku na studzienkę i 0,5 mikrograma na studzienkę jej dwóch antygenów pokrytych płytką. Na koniec oblicz osiągnięty procent dla oligonukleotydu antysensownego, EG. I przeciwciało w odniesieniu do kwasu maleinowego.

Porównaj z procentem zamierzonym przez projekt leku. To bimodalne strategiczne podejście do nanoleku wykorzystuje Herceptin do hamowania dwóch szlaków sygnałowych HER i HER dwóch specyficznych ON w celu zablokowania transkrypcji przeciwciał receptora HER dwóch ułatwiających transcytozę poprzez TFR śródbłonka naczynia nowotworowego. Platforma nano sprzężona kwas polimaleinowy została wytworzona przez hodowany mikroplazmo i oczyszczona, aktywująca grupy karboksylowe PMLA ułatwiła syntezę rusztowania presprzężonego.

I wreszcie koniugat nano ołowiu. Testy Eli SA wykazały zachowanie aktywnych przeciwciał monoklonalnych podczas syntezy nanoleków. Gdy oba przeciwciała zostały umieszczone na tej samej platformie polimerowej, fluorescencyjna mikroskopia konfokalna śledziła wychwyt komórkowy nanoleku.

Nałożone na siebie obrazy po godzinie zero i trzech godzinach analizowano razem ze znakowanymi endosomami. Współczynniki korelacji Pearsona dla kolokalizacji wskazują na uwalnianie nanoleku z endosomów do cytoplazmy i dysocjację ON od nanoleku przez zależne od glutationu rozszczepienie siarczku diss w cytoplazmie. W warunkach in vitro wiodący nanolek znacząco hamował wzrost najskuteczniej w linii komórkowej HER dwóch z nadekspresją.

Eksperymenty in vivo na myszach z BT 4 74, HER dwa z nadekspresją ludzkiego raka piersi wykazały ponad 95% hamowanie wzrostu przez wiodący nanolek zawierający Herceptin. A HER dwa specyficzne A ON ex vivo Western blot wskazywały na hamowanie zarówno syntezy HER dwóch, jak i fosforylacji rozszczepienia KT PARP oznaczonego apoptozą. Regresja guza w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne przejawia się poprzez kurczenie się guza i zubożenie komórek nowotworowych w badaniu histologicznym.

Powinieneś teraz dobrze zrozumieć, jak korzystać z biokompatybilnej nanoplatformy, aby osiągnąć skuteczne spersonalizowane leczenie bez skutków ubocznych i uzyskać nanolek o składzie kontrolnym i zweryfikowanych działaniach funkcjonalnych Po opanowaniu czujniki te można wykonywać z wysoką odtwarzalnością Po jego opracowaniu. Technika ta wykorzystująca nanoplatformę polikwasów kwasowych do ukierunkowanego dostarczania oligonukleotydów antysensownych toruje drogę naukowcom w dziedzinie spersonalizowanej medycyny ano do zbadania leczenia nowotworów ukierunkowanych na określone molekularne rynki nowotworów zidentyfikowane przez spersonalizowaną analizę genetyczną. Z farmakologicznego punktu widzenia substancje czynne i komórki mogą być niezwykle niebezpieczne.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachowywać środki ostrożności, takie jak noszenie maski i rękawicy.