Metodologia wydajnego wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie białek wirusa krowianki

Niniejszy eksperyment pozwala na generowanie rekombinowanych wirusów ospy krowiej (vaccinia) znakowanych fluorescencyjnie za pomocą modułowej i szybkiej metody opartej na przejściowej selekcji dominującej. W pierwszej kolejności należy stworzyć wektor rekombinowany zawierający znacznik fluorescencyjny otoczony syntetycznymi minimalnymi regionami homologii, a także markery do selekcji metabolicznej i fluorescencyjnej. Wektor rekombinacyjny należy wprowadzić do zainfekowanych komórek za pomocą transfekcji, a następnie namnożyć wirusy rekombinowane, stosując selekcję metaboliczną i fluorescencyjną. Następnie należy usunąć selekcję metaboliczną, aby wyciąć kasetę markerową i wyizolować komórki zawierające wirusy rekombinowane poprzez selekcję za pomocą znacznika fluorescencyjnego. Analiza plam wirusowych na monowarstwach komórkowych umożliwia wizualizację poszczególnych cząstek wirusowych charakterystycznych dla fluorescencyjnie znakowanego genu.

Opracowaliśmy tę metodę, ponieważ chcieliśmy generować wirusy rekombinowane z wieloma modyfikacjami genetycznymi, stosując metodę selekcji, którą można wykorzystywać wielokrotnie i uniwersalnie, niezależnie od zastosowanego znacznika. Choć zasada przejściowej selekcji dominantowej była opisana wcześniej, chcieliśmy zastosować ją na większą skalę i w sposób modułowy, aby zapewnić sobie większą elastyczność w wprowadzaniu modyfikacji genomowych. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, ponieważ przesiewanie i izolacja placków wirusów rekombinowanych mogą być trudne. Ich częstość występowania może być niska, w związku z czym niezbędne są specjalistyczne metody w celu efektywnego odzyskania wirusa.

Należy zatem oznakować interesujący gen wirusowy na N- lub C-końcu białka. Następnie należy zidentyfikować flankujące regiony homologii o długości 150 par zasad. Potem należy zaprojektować sekwencję oligonukleotydową obejmującą lewe i prawe ramiona o długości 150 par zasad, oddzielone wybraną parą miejsc restrykcyjnych. Region ten należy dodatkowo flankować drugą parą miejsc restrykcyjnych, różną od pierwszej pary, aby umożliwić wbudowanie w wektor TDS po syntezie. Teraz należy zweryfikować, czy oligonukleotyd z miejscami restrykcyjnymi jest zaprojektowany tak, aby zachować ramkę odczytu z pożądanym miejscem insercji. W przypadku syntezy oligonukleotydowej należy upewnić się, że miejsca restrykcyjne wbudowane pomiędzy lewym a prawym ramieniem są zgodne z miejscami flankującymi otwartą ramkę odczytu wybranego znacznika fluorescencyjnego. Te same miejsca restrykcyjne należy wprowadzić po obu stronach znacznika fluorescencyjnego za pomocą PCR. Zsyntetyzowany fragment należy sklonować do wektora TDS. Należy również sklonować znacznik fluorescencyjny do otrzymanego wektora rekombinacyjnego, wykorzystując miejsca restrykcyjne znajdujące się pomiędzy lewym a prawym ramieniem regionów homologii. Monowarstwę komórek BS-C-one należy zainfekować wirusem vaccinia w pożywce bezsurowiczej.

Godzinę po zakażeniu należy uratować komórki, stosując pożywkę Dulbecco's modified eagle medium. Wykonać transfekcję mieszaniną plazmidu wektora rekombinacyjnego i odczynników do transfekcji w stosunku trzech do jednego w pożywce bezzsółkowej. Po 24 godzinach zeskrobować i odzyskać komórki w DMEM niezawierającym płodowej surowicy bydlęcej. Poddać komórki trzem cyklom zamrażania i rozmrażania, aby rozbić komórki i uwolnić cząstki wirusa. Następnie, aby uzyskać odpowiednią separację pojedynczych plam (plaque), zakażać 100% konfluencyjne monowarstwy komórek BS-C-one seryjnymi rozcieńczeniami preparatu cząstek wirusa. Przykryć warstwą ciekłą z 10% FBS i DMEM z dodatkiem odczynników selekcyjnych GPT i inkubować przez 24 godziny.

Odssać warstwę ciekłą i przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego poszukać plam wykazujących rozproszoną czerwoną fluorescencję, odpowiadającą wbudowaniu M-cherry z wektora TDS do wirusa. W zależności od genu docelowego i wybranego znacznika fluorescencyjnego, w tej samej czerwonej plamie może być obserwowana również zlokalizowana fluorescencja genu znacznika.

Następnie należy wybrać kilka plak dla każdego wirusa rekombinowanego, zebrać je za pomocą końcówki pipety i przenieść komórki do probówki Eppendorf w 100 µL DMEM zawierającego 5% FBS. Aby uwolnić wirusy rekombinowane, należy przeprowadzić trzy cykle zamrażania i rozmrażania zebranych komórek.

Dodaj DMEM zawierający wirusa poddanego cyklowi zamrażania i rozmrażania do monowarstwy komórek w płytce 12-dołkowej, aby namnożyć wirusy rekombinowane z użyciem odczynników selekcyjnych GPT w pożywce wzrostowej. Następnie, 24 godziny po infekcji, zeskrob udanie namnożone wirusy. W celu przeprowadzenia testu płytek dla udanie namnożonych płytek wykazujących czerwoną fluorescencję, wysiej monowarstwę komórek BS-C-one w płytce 6-dołkowej.

Przeprowadzić rozcieńczenia seryjne wirusów rekombinowanych i zainfekować studzienki roztworami wirusów o zwiększonym stopniu rozcieńczenia w medium DMEM bez FBS. 1 godzinę po infekcji usunąć medium płynne i pokryć każdą studzienkę 0,5% agarozą w kompletnym minimalnym medium niezbędnym (MEM). Trzy dni po infekcji wyselekcjonować plakietki wykazujące fluorescencję zarówno czerwoną, jak i w kolorze wybranego znacznika fluorescencyjnego.

Ponownie namnożone wirusy należy przenieść bez selekcji GPT. Wybrać placki, które utraciły rozproszoną czerwoną fluorescencję, ale zachowały zlokalizowaną fluorescencję odpowiadającą wybranemu znacznikowi. Kontynuować oczyszczanie placków bez selekcji w celu uzyskania czystego zapasu wirusów rekombinowanych, które utraciły geny M-cherry i selekcji GPT, ale zachowały zlokalizowaną fluorescencję odpowiadającą wybranemu znacznikowi.

Oceń czystość zapasów za pomocą testu plackowego, dążąc do uzyskania placków o podobnym fenotypie. Namnóż testowane zapasy wirusowe w monowarstwie komórek BS-C-one. Po 24 godzinach od infekcji zeskrobuj zainfekowane komórki do 250 µL DMEM. Odwiruj zainfekowane komórki, usuń supernatant i resuspenduj osad komórkowy w 500 µL 0,1% SDS w buforze TE. Wymieszaj na wortexie, aby zlizować komórki. Następnie dodaj 500 µL fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego, a następnie odwróć probówkę, aby wymieszać zawartość. Odwiruj. Pobierz fazę górną i powtórz ekstrakcję.

Następnie, aby wyprecypitować DNA z warstwy wodnej, dodaj 1 ml schłodzonego, 100% etanolu oraz 50 µL octanu sodu. Wymieszaj poprzez odwracanie probówki i pozostaw próbkę w temperaturze -20 °C przez noc. Po odwirowaniu DNA, usuń cały płyn, wysusz pellet DNA na powietrzu i resuspenduj go w 50 µL buforu TE. Wykorzystaj ten matrycowy genomowy DNA do przesiewania PCR w celu wykrycia insercji wirusa. Wygeneruj wirusy rekombinowane z wieloma znacznikami zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym.

Te rekombinowane wirusy ospy krowiej (vaccinia) wykazują ekspresję białek znakowanych markerami fluorescencyjnymi, skierowanymi przeciwko wirusowym białkom strukturalnym A3 i F13, które są odpowiednio częścią wewnętrznego rdzenia wirusa oraz zewnętrznej otoczki. W celu wizualizacji cząstek wirusa wybrano geny odpowiadające białkom zlokalizowanym w wirionie. A3 jest białkiem rdzenia wirionu vaccinia, a F13 jest białkiem otoczki wirusowej.

Przedstawiono również wirusa z podwójnym znakowaniem, w którym zarówno białko A3, jak i F13 są znakowane fluorescencyjnie. Mikroskopia fluorescencyjna w czasie rzeczywistym może być przeprowadzona z użyciem wirusa z podwójnym znakowaniem. W tym przypadku dotyczy to białka rdzenia wewnętrznego wirusa ospy krowiej (vaccinia virus). Białko A3 jest znakowane na czerwono, a białko otoczki zewnętrznej F13 na zielono.

Nieopakowane cząstki wirusa z fabryki wirusowej są widoczne na czerwono, natomiast opakowane wiriony są reprezentowane przez kolokalizację kanałów czerwonego i zielonego. Analizę ilościową wykorzystano do określenia wydajności rekombinacji pomiędzy wektorami rekombinowanymi a genomem wirusa vaccinia. Wydajność rekombinacji homologicznej wektorów z genomem wirusa vaccinia może być wykrywana przy regionach homologii o długości zaledwie 70 par zasad.

Niniejsza metoda była wykorzystywana do tworzenia wirusów z wieloma znacznikami fluorescencyjnymi oraz/lub wielokrotnymi delecjami genów. Zostały one zastosowane w badaniach nad zakaźnym cyklem życiowym wirusa, rolą białek wirusowych w przełamywaniu systemów obronnych gospodarza, a także w analizie oddziaływań z procesami sygnalizacyjnymi gospodarza. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat generowania rekombinowanych wirusów ospy krowiej (vaccinia) przy użyciu metody, która jest modularna pod względem stosowanych znaczników, precyzyjna w wyodrębnianiu pożądanych rekombinantów i możliwa do zastosowania w różnych kontekstach badawczych.