Zmniejszone stężenie itrakonazolu i czas jego trwania są skuteczne w leczeniu zakażenia Batrachochytrium dendrobatidis u

Ogólnym celem tej procedury jest leczenie zakażonych grzybem Kitt, Bera key tridium, dendro, he lub BD za pomocą chemioterapii przeciwgrzybiczej triazolu. Osiąga się to poprzez pierwszą hodowlę kultur BD i zaszczepienie zwierząt patogenem grzybowym. Drugim krokiem jest testowanie zwierząt za pomocą ekstrakcji DNA i QPCR na wymazach ze skóry, aby zapewnić zakażenie ChAD.

Następnie zakażone zwierzęta są leczone poprzez kąpiel zwierząt w 0,0025% roztworze ekononazolu przez pięć minut dziennie przez sześć dni. Ostatnim krokiem jest monitorowanie stanu zakażenia leczonych zwierząt poprzez przeprowadzenie analizy QPCR na zamianach skóry przez co najmniej cztery tygodnie po zakończeniu leczenia w celu zapewnienia skutecznego leczenia zwierzęcia, procedura ta pokazuje, że zmniejszone stężenie i krótszy czas leczenia przeciwgrzybiczego itrakonazolu jest skuteczne w leczeniu zwierząt zakażonych bd. Główną zaletą stosowania tego schematu leczenia w porównaniu z zalecaną dawką leczniczą, która wynosi 0,01% roztwór itrakonazolu przez 11 dni, jest to, że zmniejszone stężenie o jedną czwartą zalecanej dawki i skrócony czas leczenia do sześciu dni jest nadal skuteczny w leczeniu zakażenia ChAD, ale także minimalizuje negatywne skutki uboczne stosowania zalecanej dawki leczenia.

Po inkubacji BD w bulionie trytonowym, jak opisano w protokole tekstowym i sprawdzeniu ruchu zarodników Zo, zalej każdą płytkę pięcioma mililitrami dojrzałej wody z kranu i odczekaj 10 minut, aby zarodniki ZO mogły dostać się do pożywki. Następnie przelej zawiesinę Zo Spor do przenośnego pojemnika. Oszacuj stężenie spor ZO za pomocą cytometru hemologicznego i rozcieńcz mieszaninę do stężenia jeden razy 10 do sześciu na trzy mililitry z wiekową wodą z kranu, aby zaszczepić zwierzę, takie jak pokazana tutaj Latoria vei Alpina.

Trzymaj go nad 50-mililitrowym pojemnikiem i wlej trzy mililitry mieszaniny inokulum na jego wentylację. Następnie umieść zwierzę w pojemniku ze spływem z inokulum. Umieść pokrywkę na pojemniku i pozostaw zwierzę w pojemniku do zaszczepiania na 24 godziny, aby zapewnić infekcję.

Aby zapobiec skażeniu patogenem BD. Zdejmij stare rękawice i umieść je w autoklawie przed utylizacją. Po założeniu nowej pary rękawiczek przystępuje się do zaszczepienia następnego zwierzęcia.

Po 24 godzinach od zaszczepienia zwierzęta należy umieścić w ich indywidualnych, zdezynfekowanych terrariach na dwa tygodnie. Pamiętaj, aby zdezynfekować wszystkie odpady płynne przed usunięciem, doprowadzając roztwór do 10% wybielacza po dwóch tygodniach. Przetestuj udane zakażenie BD, pobierając wymaz ze zwierząt sterylnym wacikiem.

Delikatnie obracaj wacik podczas i między pociągnięciami. Przetrzyj pięć razy na venter z każdej strony, na każdym udzie i każdej z czterech kończyn, co daje w sumie 45 uderzeń. Przechowuj waciki w mikroprobówkach o pojemności 1,5 mililitra w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Wyodrębnij genomowe DNA z wymazów za pomocą dostępnego na rynku zestawu do izolacji DNA i wykonaj QPCR zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotować trzy kąpiele lecznicze, po jednej dla każdej z trzech dawek itrakonazolu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Na kolejnym miejscu znajdują się pojedyncze w dezynfekcji.

Pojemniki na puszki o pojemności 50 mililitrów z 35 mililitrami roztworu leczniczego. Pamiętając o zmianie rękawiczek między zwierzętami, od czasu do czasu delikatnie obracaj pojemnikiem, aby upewnić się, że zwierzęta są całkowicie przykryte przez pięć minut. Po pięciu minutach zwróć zwierzęta do zdezynfekowanego obszaru.

Powtarzaj pięciominutową kurację codziennie przez dodatkowe pięć dni. Ponownie przebadać zwierzęta pod kątem zakażenia ChAD tydzień po zakończeniu leczenia i raz w tygodniu przez cztery tygodnie, aby upewnić się, że infekcja ustąpiła. Należy pamiętać, że nawet po zakończeniu leczenia zwierzęta muszą być traktowane tak, jakby nadal stanowiły ryzyko zakażenia.

Zwierzęta muszą być trzymane oddzielnie od danego obszaru przez co najmniej jeden miesiąc po zakażeniu. Jeśli zabieg się nie powiedzie, należy go powtórzyć. Różne gatunki i różne etapy życia w różny sposób reagują na zakażenie i na schematy leczenia, dlatego leczenie musi zostać przetestowane przed jego szerokim wdrożeniem.

Ponieważ BD stanowi zagrożenie biologiczne, należy co tydzień dezynfekować poszczególne terytoria, kąpiąc je i pojemniki lecznicze w 10% roztworze wybielacza. Kąpać przez co najmniej 30 sekund, zmyć wybielacz dwoma płukaniami i wodą, a następnie pozostawić pojemniki do wyschnięcia na 24 godziny przed ponownym użyciem żab, które przeżyły. Po 11 dniach leczenia ChAD lub sześciu dniach leczenia ChAD przedstawiono tutaj.

Czarne strzałki wskazują ostatni dzień kuracji. Linie ciągłe wskazują na przeżycie grup kontrolnych. Ciągłe czarne linie dotyczą zwierząt, które były zakażone ChAD, ale nie otrzymały leczenia ChAD.

A ciągłe szare linie są dla zwierząt, które były ujemne i nie były leczone w ChAD. Przerywane linie pokazują przeżycie grup leczonych otrzymujących wskazane stężenie ekonazolu. Wszystkie zwierzęta, którym podawano nebulizator 0,0025% in cous przez sześć dni, miały ujemny wynik testu na ChAD cztery tygodnie po zakończeniu leczenia, a zatem leczenie to uznano za skuteczne.

Ponadto ta dawka leczenia ekonazolem nie różniła się istotnie pod względem śmiertelności w porównaniu z kontrolami pozytywnymi BD. Należy zauważyć, że leczenie 0,01% i 0,005% ekonazolem przez 11 dni spowodowało znaczny wzrost śmiertelności w porównaniu z kontrolami pozytywnymi BD. Nie zapominaj, że patogen grzybiczy BD stanowi zagrożenie biologiczne środki ostrożności, takie jak noszenie i zmiana rękawiczek, autoklawowanie, wszystkie odpady stałe i dezynfekcja.

Wszystkie odpady płynne muszą być wykonywane zgodnie z tą procedurą.