Rekonstrukcja trójwymiarowej objętości histologicznej i jej zastosowanie do badania mysich gruczołów sutkowych
26 lipca 2014
Prezentujemy podejście do rejestracji obrazów do trójwymiarowej (3D) histologicznej rekonstrukcji objętości, które ułatwia badanie zmian zachodzących w narządzie na poziomie makrostruktur składających się z komórek. Korzystając z tego podejścia, zbadaliśmy zmiany 3D między gruczołami sutkowymi typu dzikiego i Igfbp7-null.
Ogólnym celem poniższego filmu jest przedstawienie podejścia do rejestracji obrazu w trójwymiarowej histologii, rekonstrukcji objętości w celu zbadania zmian w makrostrukturze komórkowej sutka. Aby to zrobić, gruczoły sutkowe są wycinane od myszy trzy dni po rozpoczęciu laktacji u myszy typu dzikiego i białka wiążącego insulinopodobny czynnik wzrostu siedem, IGF BP siedem myszy zerowych. Gruczoły są następnie przetwarzane i osadzane w blokach parafinowych w celu podziału.
Następnie wykonywane są obrazy twarzy bloku optycznego bloków tkankowych, a blok tkankowy jest cięty na sekcje. Obrazy przekrojów są przechwytywane i za pomocą niestandardowego oprogramowania każda sekcja jest wyrównywana z odpowiadającym jej obrazem twarzy blokowej w celu zrekonstruowania objętości histologicznej gruczołu sutkowego. Uzyskane dane podkreślają różnice w wielkości gruczołów zmutowanych i dzikich.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak trójwymiarowa konfokalna mikroskopia dwudzielna, jest to, że dostarcza ona informacji w znacznie większym zakresie przestrzennym. Metoda ta może być również wykorzystywana do badania i walidacji nowatorskich technik i algorytmów w wolumetrycznym obrazowaniu medycznym i terapiach, a także do tworzenia analiz 3D w wysokiej rozdzielczości różnych narządów. Ten zrekonstruowany tom histologiczny przedstawia wiarygodne odwzorowanie próbki procesowej bez propagowanego błędu rejestracji.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zauważyliśmy, że myszy IGF P seven null mają mniejsze rozmiary miotów i nie są w stanie utrzymać wielu dużych miotów, więc postanowiliśmy zbadać strukturę ich gruczołów sutkowych. Gdy tkanka zostanie osadzona w parafinie, użyj obrotowego mikrotomu, aby przyciąć blok, aż nadmiar parafiny zostanie usunięty. Następnie za pomocą frezarki pionowej wywierć jednomilimetrowe otwory w co najmniej dwóch rogach bloku parafinowego prostopadłego do kasety zamontuj blok tkankowy na obrotowym mikrotomie.
Następnie, aby ustawić system obrazowania twarzy blokowej przed mikrotomem, umieść kamerę z teleobiektywem pod niewielkim kątem od powierzchni bloku tkankowego. Kamera powinna być podłączona do komputera znajdującego się przed mikrotomem. Następnie umieść źródło światła przed blokiem tak, aby kamera uchwyciła odbicie światła od bloku.
Dostosuj kąt kamery, aż tkanka na powierzchni bloku będzie łatwo odróżniona od otaczającej parafiny. Uchwyć jeden obraz twarzy bloku optycznego. Następnie za pomocą mikrotomu przeciąć wstążki o czterech sekcjach o grubości pięciu mikronów.
Przenieś wstążki do kąpieli w zimnej wodzie, oddziel sekcje wstążki, a następnie zgarnij drugą i czwartą część z zimnej wody na szkiełko. Przenieś je do ciepłej kąpieli wodnej, aby usunąć zmarszczki. Wybór drugiej i czwartej sekcji zapewnia pięciomikronową przerwę między sekcjami.
Po rozciągnięciu ponownie zamontuj sekcje na mikroskopie przesuwają się przez nabieranie. Tak jak poprzednio, należy pamiętać, że cięcie, montaż i rozkręcanie marszczenia sekcji może powodować pewne zniekształcenia, takie jak rozdarcia, fałdy, skurcz i rozszerzanie. Artefakty te komplikują rejestrację skrawków histologicznych.
Zabejcuj skrawki h i d za pomocą automatycznego bejcy. Następnie nakryj szkiełka za pomocą automatycznego szkiełka nakrywkowego za pomocą cyfrowego skanera histologicznego do slajdów, zdigitalizuj slajdy w interesującej Cię rozdzielczości. W przypadku tego protokołu powiększenie wynosi 20 razy, a rozdzielczość 0,47 mikrona.
Ta część filmu zawiera przegląd procesu rejestracji obrazu, który odbywa się za pomocą specjalnego oprogramowania opracowanego w naszym laboratorium w połączeniu z MATLAB c plus plus. Korzystanie z ITK Rozpocznij od zmniejszenia próbkowania obrazów histologicznych do rozdzielczości obrazów twarzy blokowej. Spowoduje to zmniejszenie obrazów histologicznych o współczynnik 0,026.
Następnie, aby podzielić obraz na segmentację i wybrać punkt, otwórz kilka blokowych obrazów twarzy w MATLAB i użyj narzędzia kursora danych, aby zmierzyć wartości pikseli otworów rejestracyjnych. Użyj średniej wartości piksela jako stałego progu, aby podzielić otwory paseryjne na segmenty. Aby usunąć dodatkowe segmenty, użyj kolistości i obszaru podzielonych na segmenty obiektów, aby zachować otwory i usunąć dodatkowe segmenty.
Następnie dla każdego gruczołu sutkowego wybierz jeden obraz twarzy bloku jako odniesienie. Wyrównaj środki otworów rejestracyjnych pozostałej części bloku, obrazy twarzy do środków otworów rejestracyjnych obrazu referencyjnego. Następnie, korzystając z przekształceń uzyskanych dla otworów rejestracyjnych, wyrównaj obrazy powierzchni bloku dla wyrównanych obrazów twarzy bloku, ręcznie segmentuj lub wyodrębnij tkankę z tła dla sekcji h i d.
Użyj techniki progowania OSU, aby segmentować obrazy od tła i tworzyć binarne maski obrazów histologicznych. Następnie, korzystając z histogramu oznaczonych obiektów, zidentyfikuj i wybierz najbardziej duży obiekt w każdej masce. Wyodrębnij punkty graniczne o szerokości jednego piksela zarówno z masek histologicznych, jak i blokowych.
Następnie użyj algorytmu deskryptorów Fouriera, aby znaleźć początkową sztywną transformację między punktami granicznymi histologii a odpowiadającymi im obrazami twarzy blokowej. Ta początkowa transformacja obejmuje czynniki translacji, obrotu i skali. Przekształć każdy obraz histologiczny za pomocą początkowej transformacji uzyskanej w poprzednim kroku.
Aby udoskonalić pasowanie sztywne, należy usunąć odcinki krawędzi o dużej krzywiźnie z konturu histologicznego za pomocą filtra kulkowego toczącego. Następnie, stosując równomierny rozkład, losowo wybierz 500 punktów z pozostałych histologicznych punktów granicznych. Przekształć histologiczne punkty graniczne za pomocą początkowej transformacji uzyskanej z deskryptorów Fouriera.
Użyj punktów granicznych powierzchni bloku i użyj iteracyjnego algorytmu najbliższych punktów, aby znaleźć sztywną transformację między blokiem, punktami granicznymi ściany i histologią. Losowe punkty graniczne. Następnie przekształć obrazy histologiczne uzyskane w poprzednim kroku, aby utworzyć wizualny obraz objętości histologicznej w oprogramowaniu do wizualizacji 3D.
Ja vis lab, wybierz moduły, sformatuj różne pliki i dodaj moduł skomponowany 3D z plików 2D. Następnie wybierz obraz z menu i dodaj moduł konwersji właściwości obrazu. Na koniec dodaj moduł widoku 3D z modułów wizualizacji przeglądarek 3D.
Kliknij dwukrotnie Utwórz 3D z plików 2D, aby załadować obrazy i kliknij utwórz 3D. Dostosuj rozmiar woksela, klikając dwukrotnie konwersję właściwości obrazu i ustaw rozmiar woksela na 0,018 0,018 0,01. Wyświetl wolumin, klikając dwukrotnie widok 3D.
Na koniec wyświetl stos obrazów w pięciokrotnym powiększeniu, wykonując czynności opisane w dołączonym dokumencie. Aby lepiej scharakteryzować niedobór I-G-F-B-P, przeprowadzono siedmioraką rekonstrukcję 3D gruczołów sutkowych na myszach zerowych, jak opisano w niniejszym dokumencie. Ryciny te pokazują zrekonstruowane objętości histologiczne gruczołów sutkowych typu dzikiego i zerowego.
Zauważ, że zmutowany gruczoł po prawej stronie jest krótszy i węższy niż dziki typ po lewej, ale ma mniej więcej taką samą głębokość jak gruczoł dzikiego typu na głębokości 1,06 milimetra i gruczoł zerowy na głębokości 1,02 milimetra. Zauważ również, że gruczoły typu dzikiego po lewej stronie mają niewielką tkankę zrębu wskazywaną przez różowe zabarwienie eoiną, podczas gdy gruczoły zerowe po prawej stronie wydają się być głównie tkanką zrębu. W tym przypadku barwienie hemat toiny, które identyfikuje komórki jądrzaste, pokazuje, że gruczoł zerowy utrzymuje swoją gęstość, podczas gdy gruczoł typu dzikiego wydaje się zawierać głównie struktury gruczołowe.
Aby dokładniej to zbadać, obrazy obszaru węzła chłonnego o wyższej rozdzielczości zostały tutaj wyrównane. Widoczne są duże konstrukcje, które byłyby wypełnione mlekiem. Natomiast siedmiopunktowy gruczoł zerowy I-G-F-B-P ma niewiele dobrze rozwiniętych struktur.
Co więcej, struktury te są zatłoczone komórkami podobnymi do fibroblastów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć rekonstrukcję 3D narządu poprzez odbudowę odcinków seryjnych skanu. Dobry. Teraz, próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać o konsekwentnym nazywaniu slajdów i skanów, ponieważ będzie ich duża liczba, a sekwencyjna organizacja jest kluczem do sukcesu Zgodnie z tą procedurą.
Inne metody, takie jak immunohistochemia dla określonych markerów komórkowych i chorobowych, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: w jaki sposób układ naczyniowy przenika do guza?
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia podejście do rejestracji obrazów w celu trójwymiarowej rekonstrukcji wolumetrycznej histologii, koncentrując się na zmianach w makrostrukturze komórkowej gruczołów mlekowych. Poprzez badanie gruczołów mlekowych myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem genu Igfbp7, praca wskazuje na istotne różnice w wielkości gruczołów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Histologia
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Zrozumienie rozwoju gruczołu sutkowego jest kluczowe dla uzyskania wiedzy na temat laktacji.
- Techniki rejestracji obrazów usprawniają analizę danych histologicznych.
- Różnice w strukturze gruczołu sutkowego mogą wskazywać na leżące u ich podstaw mechanizmy biologiczne.
- IGF BP seven odgrywa rolę w rozwoju gruczołu sutkowego.
Cel badania
- Opracowanie metody rekonstrukcji trójwymiarowych wolumenów histologicznych.
- Porównanie różnic strukturalnych pomiędzy gruczołami mlekowymi typu dzikiego a gruczołami z deficytem IGF BP siedem.
- Ułatwienie lepszego zrozumienia makrostruktur komórkowych w gruczołach mlekowych.
Stosowane metody
- Gruczoły mlekowe wycięto z myszy trzy dni po zakończeniu laktacji.
- Gruczoły przetworzono i zatopiono w blokach parafiny.
- Dla każdego bloku tkanki wykonano obrazy powierzchni bloku w świetle widzialnym.
- Do wyrównania obrazów przekrojów z obrazami powierzchni bloku w celu rekonstrukcji objętościowej wykorzystano specjalistyczne oprogramowanie.
Główne wyniki
- Zaobserwowano znaczące różnice w wielkości między gruczołami mlekowymi mutantów a typem dzikim.
- Metoda rejestracji obrazów skutecznie zrekonstruowała objętość histologiczną.
- Uzyskane dane dostarczają informacji na temat zmian strukturalnych w gruczołach mlekowych.
- Podejście to może zostać zastosowane do innych tkanek w celu przeprowadzenia podobnych badań.
Wnioski
- Opracowana technika rejestracji obrazu jest wartościowa dla analizy histologicznej 3D.
- Różnice w strukturze gruczołów mlekowych mogą być pomocne w przyszłych badaniach nad laktacją.
- Metoda ta może pogłębić naszą wiedzę na temat organizacji komórkowej w różnych kontekstach biologicznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda umożliwia badaczom z sektora biofarmaceutycznego ilościową ocenę trójwymiarowych zmian strukturalnych w tkance gruczołu piersiowego, wspierając walidację celów w biologii gruczołów mlekowych oraz szlakach związanych z laktacją. Dzięki zapewnieniu bezbłędnej rekonstrukcji objętościowej histologii, zwiększa ona pewność prognostyczną w przedklinicznych modelach rozwoju gruczołów oraz interakcji zrąbowo-nabłonkowych. Podejście to ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka, umożliwiając bezpośrednie porównanie fenotypów typu dzikiego i mutantów w rozdzielczości makrostrukturalnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację różnic makrostrukturalnych w gruczołach piersiowych między modelami typu dzikiego a modelami z brakiem IGFBP7.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki niezawodnej wizualizacji 3D komponentów zrębowych i gruczolowych bez propagacji błędów rejestracji.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez generowanie znormalizowanych, wysokorozdzielczych trójwymiarowych wolumenów histologicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia gotowość i powtarzalność analiz dzięki spójnemu dopasowaniu przekrojów oraz ekstrakcji punktów granicznych z obrazów histologicznych i powierzchni bloków tkankowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera dopasowanie biomarkerów translacyjnych, umożliwiając wizualizację zmian strukturalnych związanych z niedoborem IGFBP7, takich jak zmniejszona wielkość gruczołów i zwiększona zawartość zrębu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej, umożliwiając bezpośrednie porównanie morfologii gruczołu mlekowego typu dzikiego oraz mutantów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy – od testowania hipotez na wczesnym etapie odkryć, po identyfikację związków wiodących i walidację przedkliniczną, w szczególności w odniesieniu do biologii gruczołu mlekowego oraz szlaków sygnalizacji z gleby.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie wizualizacji 3D makrostruktur gruczołów mlekowych w modelach genetycznych.
- Przesiewanie: Poprawia przygotowanie do analizy dzięki powtarzalnemu dopasowaniu przekrojów histologicznych z wykorzystaniem obrazów powierzchni bloku i specjalistycznego oprogramowania do rejestracji.
- Analityka: Dostarcza ilościowe pomiary zmiennych zależnych, takich jak objętość, długość, szerokość i głębokość gruczołu, umożliwiając statystyczne porównanie między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną, umożliwiając podłużną ocenę strukturalną istotną dla procesów laktacji i przebudowy tkanek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako możliwość wielokrotnego wykorzystania w celu rekonstrukcji histologicznej 3D dla wielu organów i warunków eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w modelach rozwoju gruczołów mlekowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność dzięki powtarzalnemu procesowi rejestracji obrazów z wykorzystaniem markerów powierzchniowych (blockface fiducials) i inicjalizacji deskryptorów Fouriera.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go, dostarczając mierzalnych danych fenotypowych 3D w celu priorytetyzacji celów w obrębie zrębu gruczołu mlekowego lub sygnalizacji nabłonkowej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie decyzji o rozwoju skorygowanych o ryzyko poprzez obiektywne, wolumetryczne fenotypowanie modeli genetycznych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie histologii, rejestracji obrazów oraz korzystania z autorskiego oprogramowania w środowisku MATLAB do wyboru punktów i transformacji.
- Zależność od aparatury, w tym od mikrotomu obrotowego, pionowej frezarki, kamery z teleobiektywem, źródła światła oraz systemów barwienia i skanowania histologicznego.
- Konieczność standaryzacji w ramach zespołów w zakresie nazywania preparatów, sekwencjonowania przekrojów oraz przechwytywania obrazów powierzchni bloku w celu zapewnienia dokładności dopasowania.
- Konieczność uwzględnienia adaptacji podczas stosowania metody do innych typów tkanek ze względu na różnice w wielkości, sztywności i właściwościach barwienia.
- Ograniczenia praktyczne obejmują podatność na artefakty przekrojów, takie jak rozdarcia, zagięcia i skurcze podczas montowania, co może utrudnić rejestrację.
