Nanocząstki harmoniczne w badaniach regeneracyjnych
1 maja 2014
Szczegóły protokołu są dostępne dla in vitro znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą nanocząsteczek generujących drugą harmoniczną. Przedstawiono również metodyki badania hESC za pomocą mikroskopii wielofotonowej i ich różnicowania w klastry sercowe.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest monitorowanie in vitro klastrów perełkowych serca pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w czasie rzeczywistym 3D i wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Osiąga się to poprzez hodowlę i namnażanie embrionalnych komórek macierzystych, aż utworzą one ciała Embry'ego. Następnie dudniące klastry są preparowane i powlekane na porowatych filtrach POLITETRAFLUOROETYLENU lub PTFE, co pozwala na utrzymanie ich jako powietrza przez długi czas.
Ciekłe kultury, które następnie biją klastry, są znakowane nanocząstkami harmonicznymi w celu przeprowadzenia mikroskopii wielofotonowej w czasie rzeczywistym. Uzyskane wyniki pozwalają na analizę wydłużenia przestrzennego i częstości skurczów serca w skali mikroskopowej. Główną zaletą tych nanocząstek jest to, że można użyć dowolnej długości fali, zwłaszcza podczerwieni, dzięki czemu można wejść głębiej w tkankę, a także są one bardzo stabilne w czasie.
Dzięki temu możemy monitorować nasze długie procesy w długich ramach czasowych. Ta metoda hodowli komórek macierzystych może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie funkcjonalnego skurczu kardiomiocytów w trzech wymiarach. W szczególności dojrzewanie serca i inżynieria tkankowa.
Osoby posiadające nową metodę chorobową powinny mieć świadomość, że procedura znakowania nanocząstkami harmonicznymi może być stosowana tylko do mikroskopii wielofotonowej i nie może być przeniesiona do innego rodzaju systemów obrazowania. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł wykorzystania nanocząstek harmonicznych w 2005 roku. Te nanocząstki mają przewagę w stosunku do barwników fluorescencyjnych i kropek kwantowych.
W rzeczywistości ich sygnał nie zanika z czasem i mogą być używane do monitorowania rozwijających się próbek przez długi czas. Wizualna demonstracja przygotowania próbki ma kluczowe znaczenie dla skuteczności i odtwarzalności różnych etapów, w szczególności podczas przeprowadzania testów na obecność narkotyków, i może być również stosowana do różnych tkanek lub chorób. Modelowanie tkankowe.
Po wyhodowaniu i namnażaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub ESC zgodnie z protokołem tekstowym i inkubacji ich z ciepłą kolagenazą, cztery przez 10 minut, zbierz fragmenty kolonii w dwóch mililitrach świeżego różnicowania, pożywki lub DM i wiruj przy 115-krotności grawitacji przez trzy minuty. Kultura, kolonia rozpada się w zawieszeniu w ultra niskich przyczepach. Sześć dołków na cztery dni, aby umożliwić im utworzenie ciał zarodkowych lub ebs.
Następnie połóż nowo utworzony EBS na 0,1% pokrytych żelatyną 24-dołkowych płytkach przez 15 do 30 dni, aż pojawią się bijące grona. Usuń PBS i za pomocą acutusa rozdziel kolonie na pojedyncze komórki po odwirowaniu i resus, zawieszając komórki na pożywce DM po dwa mililitry na agro. Dobrze komorować i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden dzień.
Zebrać nowo utworzony EBS i poszczepić po trzy na basenie na 0,1% pokrytych żelatyną 24-dołkowych płytkach po dwóch do czterech tygodniach w hodowli. Zidentyfikuj skupiska bijących kardiomiocytów i za pomocą wydłużonej, ostro ściętej pipety do pasty, ręcznie je wypreparuj. Umieść cztery filtry PTFE na wkładkę i umieść każdy z nich w studzience z sześciodołkową płytką.
Po dodaniu jednego mililitra DM do każdego, dobrze dodaj jeden wypreparowany klaster do ubijania na każdym filtrze PTFE. Aby oznaczyć klastry, przenieś filtry PTFE z dudniącymi klastrami do naczynia ze szklanym dnem o grubości 3,5 centymetra. Dodaj jeden mililitr nanocząstek drugiej harmonicznej w ilości 50 mikrogramów na mililitr i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby przeprowadzić nieliniowe obrazowanie optyczne.
Po przeniesieniu znakowanych HEB lub klastrów bicia serca do komory obrazowania, użyj obrazowania szerokokątnego w świetle białym w celu zidentyfikowania interesujących struktur w zróżnicowanych EBS lub aktywnych klastrach dudnienia. Wykonaj szybkie skanowanie trójwymiarowe o niskiej rozdzielczości, aby odbudować ogólną morfologię klastra sercowego i wybierz płaszczyznę obrazu w objętości klastra z kilkoma widocznymi nanocząstkami generacji drugiej harmonicznej do monitorowania w czasie rzeczywistym. Skurcze klastra serca ustawiają skaner optyczny mikroskopu w najszybszym trybie, umożliwiając wielohercową akwizycję dwuwymiarowych obrazów.
Przeanalizuj obrazy za pomocą oprogramowania MATLAB zgodnie z protokołem tekstowym, jak pokazano tutaj, przed oceną aktywności dudnienia. Charakterystyka nieliniowej odpowiedzi optycznej filtrów PTFE jest przeprowadzana w celu zapewnienia, że goły substrat do fluorescencji fotonów jest bardzo słaby i nie może przeszkodzić w pomiarze odpowiednich próbek biologicznych i emisji z izolacji. Nanocząstki drugiej generacji harmonicznej można łatwo uzyskać, obrazując przez podłoże w trybie detekcji epi.
Na tym rysunku nanocząstki drugiej generacji harmonicznej oznaczone strukturami serca i EBS są wyświetlane na ostrzu. Kolory czerwony, żółty i zielony odpowiadają autofluorescencji NADH, podczas gdy intensywnie niebieskie plamki drugiej harmonicznej pochodzą z izolowanych nanocząstek generacji drugiej harmonicznej. Zwróć uwagę na dobry kontrast optyczny i stosunkowo rzadkie znakowanie w porównaniu z kropkami kwantowymi lub nanocząstkami o konwersji w górę.
Rysunek ten ilustruje wycinek nanocząstek drugiej generacji harmonicznych oznaczonych jako klaster bicia serca. Jak pokazano w tym filmie, struktury 3D są rejestrowane z dużą prędkością, aby monitorować wzorzec skurczu w drugiej komórce. Nanocząstki generujące harmoniczne agregują się w celu utrzymania wysokiej szybkości akwizycji w celu rozdzielczości ruchu NP.
Ogólna czułość akwizycji nie była wystarczająca do zarejestrowania autofluorescencji komórek z emisją drugiej harmonicznej z drugiej generacji harmonicznej. Analiza obrazu nanocząstek przeprowadzona na klatkach filmu wskazuje, że w obrębie tej samej grupy sercowej przemieszczenia są rzędu kilku mikrometrów, a częstotliwość jest stała dla ruchu nanocząstek generacji drugiej harmonicznej w tle i poza nim. Po opanowaniu techniki przygotowania komórek, klaster zakładów rozwarstwia powietrzną hodowlę płynów powietrznych i jagnięcie można wykonać w ciągu 24 do 36 godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.
Szczególnie w przypadku tej techniki należy unikać kontaktu z otwartym powietrzem, aby zapobiec zanieczyszczeniom. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak zapisy elektrofizjologiczne przy użyciu wielu matryc elektrod, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak korelacja profili potencjału czynnościowego z częstotliwością dudnień w trzech wymiarach. Nasza nowatorska technika oparta na wykrywaniu sygnału nieliniowego przez nanocząstki harmoniczne może być dalej rozwijana w badaniach in vivo
.Jednym z możliwych osiągnięć może być integracja struktury pochodzącej z komórek macierzystych do zastosowań w medycynie regeneracyjnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół znakowania in vitro ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) przy użyciu nanocząstek generujących drugą harmoniczną. Szczegółowo opisano metodologie badania hESCs za pomocą mikroskopii wielofotonowej oraz ich różnicowania w klastry kardiologiczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Biologia serca
- Techniki mikroskopii
Wstęp
- Ludzkie embrionalne komórki macierzyste mogą różnicować się w różne typy komórek.
- Monitorowanie skupisk struktur kardiogennych (cardiac beading clusters) jest kluczowe dla zrozumienia rozwoju serca.
- Nanocząstki generujące drugą harmoniczną oferują przewagi w obrazowaniu.
- Mikroskopia wielofotonowa zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną do analizy w czasie rzeczywistym.
Cel badania
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym klastrów koralikowych mięśnia sercowego pochodzących z hESC.
- Analiza przestrzennego wydłużenia oraz częstotliwości skurczów serca.
- Wykorzystanie nanocząsteczek do obrazowania głębszych warstw tkanki.
Zastosowane metody
- Hodowla i namnażanie hESC w celu tworzenia ciał embrionalnych.
- Disekcja i wysiewanie bijących skupisk komórek na porowate filtry PTFE.
- Znakowanie bijących skupisk komórek nanocząsteczkami harmonicznymi.
- Wykonanie wielofotonowej mikroskopii w czasie rzeczywistym w celu przeprowadzenia analizy.
Główne wyniki
- Skuteczny monitoring skurczów serca w skali mikroskopowej.
- Wykazana stabilność nanocząsteczek w czasie.
- Możliwość wykorzystania różnych długości fal w celu głębszej penetracji tkanki.
- Wgląd w dynamikę zachowania klastrów kardiomiocytów.
Wnioski
- Metodologia ta umożliwia efektywne monitorowanie klastrów kardiocytów in vitro.
- Nanocząstki generujące drugą harmoniczną zwiększają możliwości obrazowania.
- Podejście to może przyczynić się do lepszego zrozumienia rozwoju serca z komórek macierzystych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Znakowanie klastrów kardiokomórk pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą nanocząsteczek generujących drugą harmoniczną (HNPs) umożliwia wysokorozdzielcze, trójwymiarowe monitorowanie dynamiki tkanek w czasie rzeczywistym, co ma kluczowe znaczenie dla badań nad regeneracją. Podejście to zapewnia stabilne obrazowanie głębokich tkanek podczas długotrwałej obserwacji dojrzewania kardiokomórek i skurczów funkcjonalnych, zwiększając wiarygodność predykcyjną w procesach wczesnego odkrywania i inżynierii tkankowej. Metoda ta usprawnia podejmowanie decyzji portfelowych, umożliwiając ilościową i powtarzalną analizę konstruktów tkankowych pochodzących z komórek macierzystych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia ilościową analizę funkcji i dojrzewania kardiomiocytów w trójwymiarowych modelach tkankowych.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez zapewnienie bezpośredniej wizualizacji zachowania skurczowego w systemach pochodnych z komórek macierzystych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów w badaniach nad inżynierią tkanki serca i medycyną regeneracyjną.
Przesiewy i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane i znakowane klastry kardiomiocytów do późniejszych analiz z wykorzystaniem obrazowania wielofotonowego.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe pomiary częstotliwości skurczów oraz wzorców przemieszczenia.
- Wspiera standaryzację i skalowalność testów w celu oceny związków w systemach istotnych dla przebiegu chorób.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami dotyczącymi biomarkerów translacyjnych, umożliwiając trójwymiarową analizę funkcjonalną konstruktów sercowych.
- Zapewnia ciągłość od modelowania tkanek na etapie odkryć do przedklinicznej walidacji terapii regeneracyjnych.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne, wspierając predykcyjną ocenę integracji i funkcji tkanek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces od odkryć naukowych do badań przedklinicznych, umożliwiając weryfikację hipotez, walidację funkcjonalną oraz analizę ilościową tkanek sercowych pochodzących z komórek macierzystych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badania mechanistyczne nad różnicowaniem i kurczliwością kardiocytów w tkankach inżynieryjnych.
- Przesiewanie: Zapewnia solidne, ilościowe wyniki obrazowania do oceny punktów końcowych funkcji.
- Analityka: Umożliwia pomiar przemieszczenia i częstotliwości skurczów do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy modelowanie tkanek in vitro z przedkliniczną oceną strategii regeneracyjnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę obrazowania i analizy z możliwością ponownego wykorzystania w różnorodnych zastosowaniach inżynierii tkankowej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad tkanką serca.
- Wartość operacyjna: Zapewnia stabilne, reprodukowalne obrazowanie podczas długoterminowych eksperymentów.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową w rozwoju portfela rozwiązań regeneracyjnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest biegłość w hodowli komórek macierzystych, inżynierii tkankowej oraz mikroskopii wielofotonowej.
- Niezbędny jest dostęp do zaawansowanych platform obrazowania oraz oprogramowania do analizy ilościowej (np. MATLAB).
- Wymagana jest standaryzacja protokołów znakowania i obrazowania między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja do innych typów tkanek lub modeli chorobowych może wymagać optymalizacji protokołu.
- Znakowanie za pomocą HNPs jest ograniczone do mikroskopii wielofotonowej i nie jest możliwe do przeniesienia na inne metody obrazowania.
