Protokół analizy replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie różnych etapów cyklu replikacyjnego wirusa zapalenia wątroby C. Jest to realizowane poprzez wstępne wytworzenie transkryptów genomowego RNA HCV z linearyzowanych konstruktów plazmidowych HCV. Drugim krokiem jest transfekcja komórek HCV RNA. Następnie komórki są wysiewane do analiz w różnych punktach czasowych. Ostatnim etapem jest pobranie supernatantu z hodowli komórkowej w celu pomiaru miana wirusa oraz odzyskanie transfekowanych komórek w celu analizy białek i RNA. Ostatecznie przeprowadzono reakcję RT-PCR, Western blotting, analizę immunofluorescencyjną oraz pomiar miana HCV, co pozwoliło na wykazanie wysokiej wydajności systemu zakaźnej hodowli komórkowej HCV.

Główną zaletą tego systemu hodowli komórkowej zakażonej wirusem zapalenia wątroby C w porównaniu z systemem replikonu HCV jest możliwość badania etapów wnikania wirusa, składania wirionów oraz ich uwalniania. Niniejszy protokół może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie wirusologii HCV, takie jak morfogeneza wirionów oraz oddziaływanie patogenu z gospodarzem. Zastosowania tej techniki rozciągają się na opracowywanie szczepionek, ponieważ umożliwia ona charakterystykę atenuowanych szczepów wirusa, które mogą być oceniane jako potencjalne kandydaty na szczepionki.

Choć metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w wirusa zapalenia wątroby typu C, można ją również zastosować do innych wirusów RNA z rodziny Flaviviridae. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mierzą się z wyzwaniem, jakim jest otrzymanie wysokiej jakości genomowego RNA HCV. Badanie pełnego cyklu replikacyjnego HCV stało się możliwe w hodowlach komórkowych po odkryciu jednego izolatu japońskiego piorunującego zapalenia wątroby wywołanego przez HCV genotypu 2A. Wizualna prezentacja testu wirusologicznego jest kluczowa, ponieważ test ten wymaga biegłości zarówno w technikach molekularnych, jak i komórkowych.

Używając wewnątrzgenotypowej chimery wirusa 2A, F-N-X-H-C-V oraz HCV F-N-X-H-C-V pol-null do oceny replikacji wirusa, zlinearyzuj wcześniej przygotowane plazmidy wirusowe poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym XBA-one w probówce o pojemności dwóch mililitrów. Następnie potraktuj plazmidy nukleazą z fasoli mung, aby uzyskać tępe końce.

Oczyszczone plazmidy po trawieniu poddano chromatografii wymiany anionowej. Integralność linearyzowanego plazmidu zweryfikowano za pomocą elektroforezy DNA w żelu agarozowym. Następnie matrycę w postaci linearyzowanego DNA plazmidowego dodano do probówki o objętości 0,2 mililitra zawierającej komponenty reakcji polimerazy RNA T7 w celu syntezy transkrypty RNA genomowego HCV.

Oczyszczone nowo zsyntetyzowane RNA traktowane DNazą za pomocą zestawu do oczyszczania RNA. Następnie zweryfikowano produkcję RNA poprzez elektroforezę w żelu agarozowym. Po tym etapie określono ilość RNA metodą spektrofotometrii.

Odseparować adherentne komórki Huh-7 za pomocą trypsyny i zebrać je do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Po dwóch kolejnych wirowaniach zawiesić osad komórkowy w zimnej pożywce z niską zawartością surowicy. Po powtórzeniu wirowania zawiesić komórki w pożywce z niską zawartością surowicy w zagęszczeniu 1×10⁷ komórek/ml.

Następnie wymieszaj łącznie 10 µg transkrybowanego wirusowego RNA z 400 µL resuspenderowanych komórek w schłodzonej wcześniej kuwecie do elektroporacji o rozmiarze 0,4 cm. Wprowadź wirusowe RNA do komórek za pomocą elektroporacji przy parametrach 270 V, 100 Ω i 950 µF. Po zakończeniu resuspenderuj elektroporowane komórki w 10 ml pełnej pożywki wzrostowej z 15% FBS. Na tym etapie wysiej komórki zarówno do kolb T 25 w zagęszczeniu około 1,2 × 10⁶ komórek na kolbę, jak i do płytek 48-dołkowych w zagęszczeniu 1 × 10⁴ komórek na dołek dla punktów czasowych 4, 48 i 96 godzin. Od czterech do ośmiu godzin po transfekcji wymień pożywkę na świeżą, uzupełnioną pożywkę wzrostową z 10% FBS, aby usunąć szczątki martwych komórek z hodowlanych kolb i płytek.

Za pomocą pipety serologicznej zebrać nadsączniki z hodowli komórkowych w punktach czasowych 48 i 96 godzin do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie usunąć resztki komórkowe z zebranych próbek poprzez wirowanie przy 15 000 rpm przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu przechowywać nadsączniki pozbawione komórek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Poddać komórki lizie w celu analizy białek i RNA za pomocą western blot oraz ilościowej reakcji PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) we wskazanych punktach czasowych. Przeprowadzić odwrotną transkrypcję jednego mikrograma całkowitego RNA komórkowego przy użyciu enzymu odwrotnej transkryptazy i specyficznego primera dla nici sensowanej HCV, który wiąże się z niekodującym regionem 5', w probówce o pojemności 0,2 mililitra. Przeprowadzić również odwrotną transkrypcję F-N-X-H-C-V-R-N-A o znanej liczbie kopii genomu przy użyciu primera nici sensowanej HCV. Wykorzystując system PCR w czasie rzeczywistym, przeprowadzić qPCR, używając 50 nanogramów otrzymanego cDNA, specyficznych primerów HCV oraz supermieszanki do qPCR zawierającej zielony barwnik wiążący DNA. Zastosować następujące warunki podczas przeprowadzania qPCR w celu oznaczenia liczby kopii H-C-V-R-N-A. Po wykonaniu qPCR poddać lizat komórkowy z transfekcji RNA wirusa w 96 godzinach po transfekcji rozdzieleniu za pomocą elektroforezy SDS-PAGE. Następnie przenieść rozdzielone białka z żelu na membranę z polifluorowęglanu difluorku (PVDF) metodą trans-blot turbo. Zablokować membranę, używając roztworu blokującego zawierającego 5% odtłuszczonego mleka i 0,2% tween-20 w PBS, i umieścić ją w pojemniku.

Inkubować membranę z mysim przeciwciałem monoklonalnym pierwszorzędowym NS3 w rozcieńczeniu 1:1000 oraz beta-aktyną w rozcieńczeniu 1:5 000 w chłodni o temperaturze 4 °C. Po inkubacji dodać przeciwciało kozie anty-mysie immunoglobulin-G sprzężone z peroksydazą chrzanową w rozcieńczeniu 1:5 000 i wykryć za pomocą chemiluminescencji.

Na tym etapie należy utrwalić komórki ztransfectedowane HCV RNA za pomocą metanolu przez 30 minut w temperaturze -20 °C przed przeprowadzeniem badania immunofluorescencyjnego. Po zakończeniu procesu komórki należy przemyć trzy razy PBS. Po zablokowaniu za pomocą buforu blokującego do testów immunofluorescencyjnych należy zastosować królicze poliklonalne przeciwciało pierwszorzędowe anty-NS5A oraz mysie monoklonalne przeciwciało anty-dsRNA J2 w rozcieńczeniu 1:200 i inkubować od pięciu godzin do nocy w chłodni w temperaturze 4 °C. Po inkubacji komórki należy przemyć trzy razy PBS po zastosowaniu przeciwciała pierwszorzędowego. Następnie należy dodać kozie poliklonalne przeciwciało wtórne anty-królicze immunoglobulin-G 488 oraz kozie poliklonalne przeciwciało wtórne anty-mysie immunoglobulin 594 w rozcieńczeniu 1:1000 i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej na wstrząsarce platformowej. Po trzykrotnym przemyciu komórek PBS należy zabarwić jądra komórkowe barwnikiem Hoechst i poddać analizie pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Następnie wysiej naiwne komórki Huh7.5.1 w liczbie około 3×10³ komórek na dołek, korzystając z płytki 96-dołkowej. Następnego dnia wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne nadsączu z hodowli wolnej od komórek, pobranego z komórek transfekowanych HCV RNA, przy użyciu pożywki wzrostowej i zaszczep w trzech powtórzeniach na komórki Huh7.5.1. Utrwal komórki 72 godziny po infekcji za pomocą metanolu przez 30 minut w temperaturze -20 °C. Po wyjęciu komórek z zamrażarki przeprowadź barwienie aminowe białka HCV NS5A zgodnie z wcześniej opisanymi warunkami. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego policz ogniska komórek dodatnich pod kątem NS5A w dołku z najwyższym rozcieńczeniem wirusa i oblicz średnią liczbę jednostek tworzących ogniska na ml.

Jakość zlinearyzowanego plazmidu HCV oceniono za pomocą elektroforezy żelowej. DNA HCV poddano transkrypcji in vitro za pośrednictwem polimerazy RNA T7, co pozwoliło uzyskać pojedynczy produkt RNA o długości 9,6 Kilobases. Wyniki RT-qPCR wskazały, że wirus typu dzikiego efektywnie replikował genom. Typ dziki wykazywał poziom replikacji genomu od jeden do trzech log wyższy w porównaniu z wirusem pol-null.

Wirus typu dzikiego produkował białko NS3 biorące udział w cięciu białek wirusowych i replikacji genomu. Wirus typu dzikiego wykazuje również ekspresję białka NS5A; białko NS5A oraz dwuniciowy RNA współistniały w cytoplazmie komórek z transfekcją wirusem typu dzikiego, co sugeruje aktywną replikację wirusa. Pomiary miana wirusa wykazały, że wirus typu dzikiego jest zakaźny i produkuje ponad 10 000 jednostek tworzących ogniska na mililitr cząstek zakaźnych. Sześć godzin po transfekcji zarówno wirusy typu dzikiego, jak i pol-null wykazywały podobną aktywność lucyferazy, co wskazuje na przełożenie podobnej ilości wprowadzonego transkryptu RNA. Jednak w 48. i 96. godzinie po transfekcji wirus typu dzikiego wykazał zwiększony poziom replikacji genomu w porównaniu z wirusem pol-null. Wirus typu dzikiego produkował również wirusowe białko NS3. Wirus pol-null wykazywał podstawowy poziom aktywności lucyferazy, podczas gdy wirus typu dzikiego wykazywał poziom replikacji o dwa do trzech rzędów wielkości wyższy w porównaniu z wirusem reporterowym pol-null. Po opanowaniu metody testy wirusologiczne HCV mogą być wykonane w ciągu dwóch tygodni, jeśli są prowadzone prawidłowo. Podczas próby zastosowania tej procedury ważne jest posiadanie stabilnych linii komórkowych oraz wysokiej jakości transkrypcyjne RNA genomowe HCV. Po zastosowaniu tej procedury scharakteryzowane szczepy HCV mogą być testowane w modelach zwierzęcych w celu zbadania przystosowania in vivo oraz interakcji między gospodarzem a patogenem.

Opracowanie zakaźnego systemu hodowli komórkowej HCV utorowało badaczom drogę do zgłębienia etapów morfogenezy wirionów oraz uwalniania wirusa w cyklu replikacyjnym HCV. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania różnych testów wirusologicznych służących do charakteryzacji poszczególnych etapów cyklu replikacyjnego wirusa zapalenia wątroby typu C. Należy pamiętać, że praca z wirusem zapalenia wątroby typu C może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiedniego indywidualnego sprzętu ochronnego.