NAJLEPSZE: Sekwencjonowanie tetrad z obsługą kodów kreskowych

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie dużej liczby rekombinowanego potomstwa z krzyżówki drożdży w sposób, który zachowuje informacje o tym, które potomstwo pochodzi z tej samej oryginalnej tetrady. Osiąga się to poprzez najpierw przekształcenie heterozygotycznego szczepu diploidalnego do użycia w krzyżówce za pomocą biblioteki plazmidów, która zawiera tetraspecyficzny kod kreskowy i reporter fluorescencyjny specyficzny dla zarodnikowania. Drugim krokiem jest przeniesienie komórek z kodami kreskowymi na pożywkę zarodnikową.

Pozwala to na tworzenie się tetras i indukuje ekspresję reportera fluorescencyjnego GFP w Tetras, ale nie w komórkach, które nie są w stanie zarodnikować. Następnie sortownik faksów oddziela znakowane fluorescencyjnie tetra od innych komórek i umieszcza je bezpośrednio na płytce agarowej, gdzie zewnętrzna powłoka tetra jest trawiona enzymatycznie. Ostatnim krokiem jest użycie szklanych kulek do oddzielenia i rozprowadzenia zarodników strawionych tetra na powierzchni płytki agarowej, pozwalając każdemu zarodnikowi utworzyć pojedynczą kolonię.

Ostatecznie szczepy uzyskane tą metodą zostaną zgenotypowane przy użyciu protokołu sekwencjonowania DNA o wysokiej przepustowości, który odczyta kod kreskowy specyficzny dla tetra każdego szczepu. Kody kreskowe są następnie wykorzystywane do identyfikacji każdego z czterech szczepów, które powstały w wyniku pojedynczego zdarzenia miotycznego. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ręczna sucha sekcja Teda przy użyciu mikromanipulatora, jest to, że jeden badacz może wyizolować kilka tysięcy rekombinowanych potomstwa w ciągu zaledwie kilku godzin.

Diploidalne komórki drożdży użyte w tym badaniu zostały wcześniej przekształcone za pomocą biblioteki plazmidów z kodami kreskowymi, jak opisano w dołączonym manuskrypcie i przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby ożywić komórki z zamrożonych łodyg. Hoduj je przez noc w pięciu mililitrach YPD plus 200 mikrogramów na mililitr G cztery 18 w temperaturze 30 stopni Celsjusza z mieszaniem następnego dnia. Umyj komórki z kultur nocnych trzykrotnie w PBS, a następnie ponownie zawieś komórki do końcowej objętości dwóch mililitrów w pożywce zarodnikowej plus 200 mikrogramów na mililitr.

G cztery 18 Mieszać kultury zarodnikowe w temperaturze pokojowej. Codziennie monitoruj postęp zarodnikowania, aż nowe tetrady przestaną się formować. Zazwyczaj trwa to od dwóch do czterech dni, gdy kultury zawierają dobrze uformowane tetrady i stosunkowo niewiele diad.

Usuń kultury z mieszania i pozostaw w temperaturze pokojowej na co najmniej siedem dni przed sortowaniem tetradowym. Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest uzyskanie dobrej separacji zarodników. Odkryliśmy empirycznie, że pozostawienie kultur zarodników w temperaturze pokojowej bez mieszania przez co najmniej tydzień przed sortowaniem tetradowym znacznie poprawia separację zarodników.

Tetrady z kultury zarodnikowej można wykryć i wyizolować za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją lub faksu, ponieważ plazmidy oznaczone kodami kreskowymi w komórkach diploidalnych zawierają również białko fuzyjne GFP specyficzne dla zarodnikowania. Opisany tutaj protokół został opracowany dla faksu aria do dwóch. Aby rozpocząć tę procedurę, załaduj zarodnikowaną kulturę do sortera faksów i ustaw dwie bramki rozpraszania do przodu i boczne, aby wykluczyć zanieczyszczenia, zlepione komórki i wiele komórek na kroplę.

Powinna istnieć populacja komórek fluorescencyjnych, która przy użyciu konstruktu reporterowego PS two GFP obejmuje chód diad i tetrad, GFP w porównaniu z FSC, aby uwzględnić te zdarzenia fluorescencyjne. W zależności od tła szczepu może być konieczne dodanie dodatkowego chodu w celu usunięcia grudek zawierających tetry i inne komórki. Sprawdź histogram FSC zdarzeń fluorescencyjnych.

W tym przykładzie zdarzenia w lewym piku są głównie tetrasami, a zdarzenia w prawym piku są na ogół tetras z dołączonym pączkiem, który stosuje końcową bramkę, która obejmuje zdarzenia z niższym FSC, które są w większości tetras wskazywane przez czerwone paski. Sprawdź skuteczność reżimu bramkowania, sortując około 1 500 tetrad na szkiełku mikroskopowym i licząc stosunek tetrad do nietetrad. Używając mikroskopu z kontrastem fazowym przy 400-krotnym powiększeniu, procent tetrad można dokładnie oszacować, licząc tylko około 200 posortowanych zdarzeń, ale sortowanie około 1500 skraca czas spędzony na poszukiwaniu komórek na szkiełku mikroskopowym.

Te obrazy w jasnym polu powiększają się 600-krotnie. Pokaż przykłady tetrad po lewej stronie i nietetrad po prawej stronie po sortowaniu faktów. Okresowo sprawdzaj, czy sorter dokładnie podaje liczbę zdarzeń, sortując 25 tetra na szkiełku mikroskopowym i badając komórki zawarte w kropli za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym przy 400-krotnym powiększeniu.

W kropli powinno znajdować się 25 tetrad. Powtórz te czynności trzy lub cztery razy, aby ocenić wariancję faksu w tym przebiegu. Przygotuj płytki agarowe do tej procedury, podgrzewając żądaną liczbę płytek YPD plus G cztery 18 przez co najmniej 1,5 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza umieszczonym w pobliżu sortera faksów.

Kluczową cechą protokołu sortowania jest możliwość precyzyjnego kierowania posortowanych faksem tetrad do określonego miejsca na płytce agarowej, która zawiera pulę roztworu X. Aby to zrobić, najpierw umieść charakterystyczną 96-dołkową płytkę na zautomatyzowanym urządzeniu do osadzania komórek sortera. Następnie przygotuj układ sortowania, który posortuje 25 tetra w jednym dołku 96.

Dobrze formatowane sortowanie 25 tetras na płytkę daje dobrze oddzielone kolonie. Wybierz studnię w pobliżu środka talerza. Na przykład dobrze D pięć.

Przynieś stos 10 płytek agarowych z inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza do sortera. Weź jedną płytkę agarową i odpipetuj 25 mikrolitrów roztworu zy na agar w pobliżu środka płytki. Następnie umieść płytkę na płytce dołka landmark 96, wyrównując kroplę X nad celem.

Cóż, to zostało wybrane wcześniej. Cóż, D pięć. Rozpocznij sortowanie i umieść 25 tetras w środku kropli zy na płytce agarowej.

Zdejmij i przykryj płytkę. Powtarzaj sortowanie dla każdej płytki, aż 25 tetrad zostanie posortowanych na kropelki zamo na każdej płytce w stosie. Umieść stos płytek zawierających tetra z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Przynieś następny stos 10 płytek do sortera i powtórz procedurę sortowania. Zarodniki można oddzielić po inkubacji tetrady zawierającej płytki agarowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj od 15 do 25 sterylnych trzymilimetrowych szklanych kulek do każdej płytki i potrząsaj płytkami jako dwoma stosami po pięć płytek przez trzy do pięciu minut.

Najlepszą separację zarodników uzyskuje się poprzez sztywne przesuwanie płytek z boku na bok lub z przodu do tyłu. Nie przesuwaj płytek w taki sposób, aby koraliki wirowały wokół zewnętrznej krawędzi płyty. Po zakończeniu pozostaw koraliki na talerzach.

Umieść stos talerzy z koralikami do góry w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza. Wyjmij następny stos płytek z inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i powtórz procedurę separacji zarodników za pomocą kulek. Inkubuj wszystkie płytki przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza następnego dnia po oddzieleniu zarodników.

Ostrożnie wyjmij płytki z inkubatora o temperaturze 30 stopni Celsjusza, nie naruszając szklanych kulek. Na płytkach powinny powstać małe kolonie. Usuń szklane koraliki, ostrożnie i szybko odwracając talerze nad głębokim pojemnikiem.

Stuknięcie w dolną część płytki, gdy jest ona odwrócona, może pomóc w usunięciu koralików, które są przyklejone do płyty. Pojemniki powinny być wystarczająco głębokie, aby złapać koraliki, nie pozwalając im podskakiwać i uderzać w płytkę agarową. Policz liczbę kolonii na każdej płytce i użyj liczby kolonii, aby oszacować skuteczność separacji i odzyskiwania zarodników.

Na przykład 25 tetrad na płytkę dla krzyżówki o prawie 100% żywotności może dać w sumie 100 kolonii na płytkę z płytek o wystarczającej liczbie kolonii, takiej jak 65, aby uzyskać wysoką żywotność. Przenieś krzyżowo komórki z każdej kolonii do oddzielnego dołka z 96-dołkową płytką zawierającą płyn YPD plus G cztery 18. Zwróć również uwagę na to, które studzienki zawierają kolonie z tej samej płytki agarowej.

Te informacje zostaną później wykorzystane do pomocy w przypisaniu tetra. Najlepsze oprogramowanie może znacznie poprawić szybkość, z jaką można wyizolować zarodniki z tetrad. Chociaż obecna iteracja metody ma pewną utratę wydajności w porównaniu z ręcznym rozbiorem, rozkład dwumianowy został wykorzystany do obliczenia oczekiwanej frakcji tetrad z co najmniej jednym pomyślnie odzyskanym zarodnikiem wytwarzającym 1, 2, 3 lub cztery kolonie w oparciu o proporcję wszystkich pomyślnie odzyskanych zarodników.

Ten wykres może służyć jako przybliżony przewodnik po liczbie szczepów, które ostatecznie zostaną złożone w trzy lub cztery tetra zarodników, jak zaobserwowano tutaj. Liczba odzyskanych kompletnych teter wzrasta wraz ze wzrostem liczby kolonii na płytce w tym badaniu. Na 149 płytkach agarowych posiano 25 radów z całej powierzchni o żywotności zarodników bliskiej 100%, jak określono podczas ręcznej sekcji.

Maksymalna liczba kolonii zaobserwowanych na płytce wynosiła 80, co wskazuje, że 20 zarodników nie zdołało utworzyć odrębnych kolonii. Średnia liczba kolonii na płytce wynosiła 62 4, 354 kolonie z 61 płytek zawierających 65 lub więcej kolonii zostały zebrane i zsekwencjonowane. Spośród 3 700 szczepów, które przeszły kontrolę jakości sekwencjonowania, 2 665 lub 72% można obliczeniowo przypisać do trzech lub czterech tetrad przetrwalnikowych po opanowaniu.

Ta technika może być używana do przetwarzania ponad tysiąca tetrad na godzinę. Chociaż w przypadku precyzji dłuższych niż trzy godziny będziesz potrzebować pomocy.