In vitro Testy agregacyjne z użyciem hiperfosforylowanego białka Tau
2 stycznia 2015
Niezmodyfikowane i hiperfosforylowane białka tau zostały użyte w dwóch testach agregacji in vitro, aby ujawnić kinetykę szybkiej agregacji zależnej od hiperfosforylacji. Testy te torują drogę do przyszłych badań przesiewowych dla związków, które mogą modulować skłonność hiperfosforylowanego tau do tworzenia włókienek, które leżą u podstaw postępu choroby Alzheimera.
Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie i porównywanie kinetyki agregacji niezmodyfikowanych i hiperfosforylowanych form białka tau. Osiąga się to poprzez najpierw wygenerowanie niezmodyfikowanego i hiper ufosforylowanego białka tau przez system katalizatora wspomagany zamkami błyskawicznymi. Drugim krokiem jest skonfigurowanie testów agregacji tak, aby były odpowiednie dla jednego z dwóch różnych instrumentów.
Proces agregacji tau jest monitorowany przez fluorescencję dwóch różnych tio. Flawina umiera, flawina S i flawina T. Ostatnim krokiem jest wykreślenie i porównanie krzywych agregacji. Ostatecznie zmiany kinetyczne fluorescencji tioflawiny od wiązania do zagregowanych gatunków TA są wykorzystywane do wykazania zależnego od hiperfosforylacji wzmocnienia migotania tau in vitro.
Cześć.Witamy w naszym artykule JOV. Testy agregacji in vitro z użyciem białka hiper fosfo tau. Nazywam się Minko, a eksperymenty będą przeprowadzane i demonstrowane w sposób niepowtarzalny.
A dla tego protokołu w ciągu ostatniego miesiąca utworzono dość świeży bufor agregacji. Tuż przed użyciem dodaj DIO trzy etol do jednego milimola, również wymagane jest przefiltrowane herbata Theo Flavin lub roztwór podstawowy S. Roztwór podstawowy Heina, zarówno przechowywany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, jak i białko ręcznika przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Pociągnij ręcznik po lodzie, a następnie dostosuj jego stężenie za pomocą buforu agregacyjnego zgodnie z wymaganiami dotyczącymi konsystencji. Odwiruj ręcznik z buforem agregacyjnym i 20 800 G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Teraz przenieś supinat do innej probówki i trzymaj go na lodzie, aż nadejdzie czas na złożenie reakcji agregacji.
Ustaw mieszaninę agregacyjną w 1,5-mililitrowych mikrorurkach centrycznych. Zgodnie z tabelą 100 mikrolitrów wystarcza na jedną porcję reagentów. Oblicz całkowitą objętość na podstawie liczby reakcji i zwiększ ją o 10%, aby uwzględnić błędy pipetowania.
W razie potrzeby pieprz można zastąpić kwasem raonowym lub buforem agregacyjnym. Wymieszaj reakcje przez odwrócenie i przenieś je do 37 stopni Celsjusza bez wegetacji. Po każdych 24 godzinach uzupełniaj reakcje dodatkowym jednym milimolowym DTT, aby zapewnić środowisko redukujące do pomiaru fluorescencji.
Rozgrzej fluorymetr widmowy przez około 10 minut. Poprawi to spójność pomiarów w oprogramowaniu komputerowym. Wybierz tryb wyświetlania w czasie rzeczywistym znajdujący się w centrum sterowania instrumentami.
Ustaw długość fali wzbudzenia na 450 nanometrów ze szczeliną na dwóch nanometrach i ustaw długość fali emisji na 510 nanometrów ze szczeliną pięciu nanometrów. Następnie wróć do centrum sterowania instrumentem i wybierz analizę stałej długości fali. Naciśnij dodawania w górnej ramce, aby dodać zestaw długości fal.
Ustaw parametry akwizycji błędu standardowego na jeden, a maksymalną liczbę prób na trzy. Następnie kliknij przycisk dodaj. Następnie kliknij przejdź, aby otworzyć okno wyświetlania danych.
Teraz w oknie wyświetlania danych kliknij na start act, aby otworzyć okno dialogowe nowej próbki i wybierz nieznany jako typ próbki. Następnie przygotuj reakcje, aby wykonać pomiary co 100 mikrolitrów w 98. Mikrolitry buforu agregacyjnego i dwa mikrolitry trzech milimolowych flawiny S lub T kilkakrotnie odpipetować mieszaninę, aby zapewnić dobre wymieszanie.
Przenieś wszystkie 200 mikrolitrów jednej mieszaniny do FA three qve i załaduj ją na miejsce. Następnie liż bieg, aby zebrać dane dotyczące fluorescencji Po usunięciu roztworu z weterynarza spłucz go trzykrotnie wodą destylowaną i wysusz w strumieniu powietrza. Test ten obejmuje barwnik fluorescencyjny w reakcji aionowej, co pozwala na ciągłe pomiary i lepiej jest je wykonać za pomocą automatycznego czytnika płytek matowych.
Zwykły parametr for również działa, jest ograniczony szybkością obsługi ręcznej. Ustaw mieszankę agregacyjną na 96-dołkowej, nieprzezroczystej czarnej płytce. Przy 360 mikrolitrach objętość studni 200 mikrolitrów wystarcza na każdy pomiar punktu czasowego.
Dobrze wymieszać każdą reakcję z pipetowaniem. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i co 24 godziny dodawać dodatkowy jeden milimolowiec DTT, aby zapewnić środowisko redukujące w każdym punkcie czasowym. W celu wykonania pomiaru należy włączyć wielomodowy czytnik mikropłytek i komputer co najmniej 10 minut wcześniej w oprogramowaniu komputerowym.
Ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza i wybierz tryb intensywności fluorescencji. Następnie ustaw długość fali wzbudzenia na 450 nanometrów, a długość fali emisji na pięć i 10 nanometrów. Włóż płytkę 96-dołkową do pobierania i naciśnij odczytu.
Po wykonaniu pomiarów należy natychmiast zwrócić płytkę do inkubatora przed analizą danych, test w trybie ciągłym można przeprowadzić przy użyciu kompaktowego spektrofotometru do tego testu. Umieść mieszaninę agregacyjną w 1,5-mililitrowych mikroprobówkach wirówkowych. Do zmierzenia punktu czasowego wystarczy 200 mikrolitrów reakcji.
Odwróć probówki, aby wymieszać. Ustaw reakcje w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub temperaturze pokojowej i dodawaj dodatkowy jeden milimol DTT co 24 godziny, aby wykonać pomiary. Skonfiguruj urometr i oprogramowanie tak, jak to zrobiono dla testu terminala bez matrycy.
Przenieś całą mieszaninę do weterynarza i umieść ją w uchwycie na próbkę w komorze na próbkę i zamknij pokrywę. Kliknij przycisk uruchom, aby zebrać dane dotyczące fluorescencji w odpowiednich odstępach czasu. Jeśli ten odstęp jest krótki, na przykład 30 lub 60 sekund, można pozostawić weterynarza Q w maszynie między pomiarami, aż do osiągnięcia ostatniego punktu czasu.
Zwróć reakcję z weterynarza do probówki z próbką i zwróć probówkę do inkubatora Po zakończeniu. Odchudź weterynarza zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami, używając rekombinowanego tau i P tal. Ustanowiono dwa różne protokoły w celu porównania kinetyki agregacji tau i p tal, wykorzystując silną fluorescencyjną emisję flawonów i s po związaniu się z agregatami białek amyloidowych, w tym tau i p tal, z barwnikiem fluorescencyjnym lub bez niego.
W reakcji agregacji zaobserwowano konsekwentne zwiększanie agregacji tau przez hiperfosforylację. Zazwyczaj T i p tal liga rosną szybko w ciągu pierwszych 30 minut, zanim nastąpi spowolnienie znaczenia, w tym flawiny. T w reakcjach agregacji powodują znaczne opóźnienie szybkości agregacji.
Zarówno Theof Flavian s, jak i t zbliżyły się do plateau po 160 minutach reakcji. Z drugiej strony bioflawiny nie powodowały znaczącego spowolnienia agregacji. Po tej procedurze można wykonać dodatkowe ośrodkowego układu nerwowego do izoform lub innych białek podatnych na agregację w neurodegeneracji, takich jak w teście, aby zrozumieć udział izacji białka w patogenezie po jego rozwoju.
Ta technika przygotowania hiperfosforanowego białka PA sposób na badania w terenie, liczne choroby w celu zbadania naszych terapii i rozwoju leków.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje kinetykę agregacji niemodyfikowanych i hiperfosforylowanych białek tau z wykorzystaniem testów in vitro. Wyniki wskazują na zależne od hiperfosforylacji nasilenie fibrylizacji białka tau, co ma istotne znaczenie dla zrozumienia progresji choroby Alzheimera.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Badania nad chorobą Alzheimera
Wprowadzenie
- Białka tau są kluczowe dla stabilizacji mikrotubul w neuronach.
- Hiperfosforylacja białka tau wiąże się z chorobami neurodegeneracyjnymi.
- Zrozumienie agregacji białka tau jest niezbędne do opracowania strategii terapeutycznych.
- Testy in vitro mogą dostarczyć informacji na temat kinetyki agregacji białka tau.
Cel badania
- Porównanie kinetyki agregacji niezmodyfikowanych i hiperfosforylowanych białek tau.
- Opracowanie metody przesiewowej dla związków, które mogą wpływać na agregację białka tau.
- Wyjaśnienie roli hiperfosforylacji w fibrylizacji białka tau.
Zastosowane metody
- Generowanie niemodyfikowanych i hiperfosforylowanych białek tau z wykorzystaniem katalitycznego systemu wspomaganego przez tzw. zippers.
- Przygotowanie testów agregacji dostosowanych do różnych urządzeń pomiarowych.
- Monitorowanie agregacji białka tau przy użyciu fluorescencji barwników tioflawinowych.
- Wykresowanie i porównywanie krzywych agregacji w celu oceny zmian kinetycznych.
Główne wyniki
- Hiperfosforylowane białko tau wykazuje szybszą kinetykę agregacji w porównaniu do niezmodyfikowanego białka tau.
- Pomiary fluorescencji korelują z szybkością tworzenia się włókien tau.
- Badanie dostarcza podstaw do przyszłych przesiewów związków modulujących tau.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw choroby Alzheimera.
Wnioski
- Hiperfosforylacja znacząco przyspiesza kinetykę agregacji białka tau.
- Testy in vitro są skuteczne w badaniu zachowania białka tau.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu zbadania interwencji terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten test umożliwia bezpośrednią ocenę kinetyki agregacji hiperfosforylowanego białka tau, która jest kluczowym czynnikiem patologicznym w chorobie Alzheimera i powiązanych z nią tauopatiach. Dzięki zastosowaniu istotnych dla choroby, zmodyfikowanego potranslacyjnie białka tau, metoda ta zwiększa pewność walidacji celu i wspiera wczesne ograniczanie ryzyka w testowaniu hipotez terapeutycznych. Stanowi ona skalowalną, ilościową platformę do przesiewu związków modulujących fibrylację białka tau, co jest zgodne z przedklinicznymi procesami oceny zaangażowania celu oraz identyfikacji wiodących kandydatów na leki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezę terapeutyczną, według której hiperfosforylacja napędza patogenne agregowanie białka tau.
- Wartość operacyjna: Umożliwia bezpośrednie porównanie zmodyfikowanego i niemodyfikowanego białka tau w celu wyizolowania efektów zależnych od fosforylacji.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wyboru celu terapeutycznego poprzez powiązanie określonej modyfikacji molekularnej z mierzalną fibrylogenezą.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Wykorzystanie fluorescencji tioflawiny S i T do ilościowego monitorowania kinetyki agregacji w czasie rzeczywistym.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z czytnikami mikropłytek i spektrofotometrami, co umożliwia skalowalne i powtarzalne pomiary.
- Gotowość testu: Możliwość adaptacji do wysokoprzepustowego przesiewania bibliotek związków przeciwko hiperfosforylowanemu białku tau.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wykorzystanie rekombinowanego hiperfosforylowanego białka tau do modelowania konformacji białka istotnej dla przebiegu choroby.
- Znaczenie przedkliniczne: Dostarcza odczytu mechanistycznego dotyczącego oddziaływania z celem w programach badawczych nad neurodegeneracją.
- Łagodzenie ryzyka: Umożliwia wczesną ocenę wpływu związków na agregację białka tau przed badaniami komórkowymi lub in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w początkową fazę procesu odkrywania leków, wspierając walidację celu poprzez mechanistyczne ograniczanie ryzyka oraz umożliwiając identyfikację hitów w kaskadach przesiewowych. Wynik ilościowy analizy stanowi podstawę do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w oparciu o biochemiczną aktywność specyficzną dla danego celu.
- Biologia odkryć: Testuje hipotezę, według której hiperfosforylacja nasila fibrylację białka tau, będącą kluczowym mechanizmem w patogenezie taukopatii.
- Przesiewanie: Generuje zależne od dawki dane kinetyczne, odpowiednie do oceny wpływu związków na tempo agregacji.
- Analityka: Pozwala na uzyskanie krzywych agregacji opartych na fluorescencji, co umożliwia porównanie czasu lagu, szybkości wzrostu oraz wartości plateau.
- Badania translacyjne: Łączy modulację celu biochemicznego z patologią białek istotną dla przebiegu choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalną platformę testów biochemicznych dla programów ukierunkowanych na białko tau w odniesieniu do wielu celów i modalności.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez izolację wpływu hiperfosforylacji białka tau na agregację.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane przygotowanie odczynników i ustawienia aparatury zapewniają powtarzalność wyników między laboratoriami i w różnych punktach czasowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia przewidywanie skuteczności modulacji celu, redukując ryzyko niepowodzenia na późniejszych etapach przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków w oparciu o dane dotyczące specyficznej dla celu aktywności biochemicznej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z białkami, spektroskopii fluorescencyjnej oraz projektowaniu testów agregacji.
- Zależność od dostępu do fluorymetrów lub czytników mikropłytek z konfigurowalnymi ustawieniami wzbudzenia/emisji.
- Wymaga standaryzowanego przygotowania odczynników, w tym świeżego buforu do agregacji oraz suplementacji DTT.
- Należy uwzględnić zmienność zachowania agregacji białek w zależności od partii i warunków przechowywania.
- Ograniczenie do układów in vitro; metoda nie obejmuje mechanizmów oczyszczania komórkowego, zasiewania ani neurotoksyczności.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
Preparations
2:14
Terminal Assay with No Dye
4:44
Continual Mode Assay Using a Plate Reader With Dye
6:14
Continual Mode Assay Using a Compact Spectrofluorometer With Dye
7:33
Results: Tau Aggregation Assayed by Different Modes and Instruments
8:34
Conclusion
