Kompleksowa analiza dynamiki transkrypcji z próbek mózgu po doświadczeniu behawioralnym
26 sierpnia 2014
Ten manuskrypt opisuje protokół, który stosuje kompleksowe profilowanie do analizy programów transkrypcyjnych indukowanych w określonych jądrach mózgowych gryzoni zgodnie z paradygmatami behawioralnymi. W niniejszym artykule podejście to zostało zilustrowane w kontekście profilowania genów indukowanych w jądrze półleżącym (NAc) myszy po ostrej ekspozycji na kokainę, z wykorzystaniem mikroprzepływowych macierzy qPCR.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie dynamiki transkrypcji i zdefiniowanych jąder mózgowych myszy po doświadczeniach behawioralnych. Osiąga się to poprzez uprzednie przyzwyczajenie zwierząt i zarejestrowanie ich aktywności lokomotorycznej po wstrzyknięciu soli fizjologicznej. Po przyzwyczajeniu aktywność lokomotoryczna jest rejestrowana po pojedynczej dawce kokainy, a następnie pobierane są próbki z jądra półleżącego i wykorzystywane do izolacji RNA i przygotowania CDNA.
Następnie przeprowadzana jest analiza QPCR w celu zbadania ekspresji genów indukowanej zachowaniem. Ostatecznie uzyskuje się wyniki, które pokazują dynamikę transkrypcji po doświadczeniu z kokainą Demonstrując protokół będzie dr Hatu, kierownik laboratorium, Dum Muer, absolwent z laboratorium i Duran, student studiów licencjackich z laboratorium przez trzy kolejne dni. Każda mysz jest przyzwyczajona do procedur obchodzenia się i wstrzykiwania, organizuje myszy w klatki przed rozpoczęciem eksperymentu, tak aby myszy nie były przenoszone między klatkami w przyszłości, a myszy nigdy nie były pozostawione w izolacji przez dłuższy czas.
Na 30 minut przed rozpoczęciem badania wszystkie klatki testowe powinny zostać przeniesione do pomieszczenia behawioralnego, aby umożliwić zwierzętom zaaklimatyzowanie się w środowisku. Natychmiast po wstrzyknięciu należy podać dootrzewnowe wstrzyknięcie 250 mikrolitrów soli fizjologicznej, umieścić mysz w komorze behawioralnej w celu monitorowania aktywności lokomotorycznej przez 15 minut. Mysz można było umieścić w komorze behawioralnej na 20 minut.
Aktywność monitorowana od drugiej do 17 minuty. Powtarzaj te czynności o tej samej porze dnia przez kolejne dwa dni. Czwartego dnia podaj pojedynczy zastrzyk kokainy lub soli fizjologicznej, w zależności od grupy, i natychmiast umieść mysz w komorze, aby monitorować lokalną aktywność motoryczną przez 20 minut w wybranych punktach czasowych po ekspozycji na kokainę, wyekstrahuj mózg i umieść go w lodowatym roztworze płynu mózgowo-rdzeniowego na jedną do dwóch minut, aby sschłodził się i stwardniał.
Po usunięciu móżdżku i odprowadzeniu nadmiaru płynu, przyklej mózg do stanu vibram z częścią rostralną skierowaną do góry. Napełnij komorę lodowatym płynem płynu mózgowo-rdzeniowego A i pokrój 200 mikronów, aż jądro półleżące zostanie wyraźnie zidentyfikowane. Zwróć szczególną uwagę na kształt ciała modzelowatego, położenie i kształt spoidła przedniego oraz komór podczas cięcia.
Po zidentyfikowaniu właściwego regionu pokrój dwa odcinki o wielkości 400 mikronów, z których jądro półleżące zostanie wycięte pod stereoskopem. Użyj cienkiego ostrza, aby wyciąć jądro półleżące z dala od plastrów. Cztery szybkie ruchy ostrza w odpowiednim obszarze powinny natychmiast odizolować odpowiednią tkankę.
Umieść izolowaną tkankę w 900 mikrolitrach odczynnika do lizy i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do ekstrakcji RNA, aby rozpocząć rozmrażanie probówek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i homogenizację. Używając igły o rozmiarze 25, pierwsze kilka rund może być trudne i wymagać dociśnięcia tkanki do ścianki rurki w celu homogenizacji jej na małe kawałki. Aby zapewnić prawidłową homogenizację, odpipetuj lizat na mini kolumnę wirową niszczarki kaya i odwiruj.
Odpipetować lizat do nowej probówki mikrowirówki i wyekstrahować RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Po oczyszczeniu RNA przeprowadza się odwrotną transkrypcję do CDNA, a także specyficzną dla celu amplifikację wstępną próbek za pomocą starterów skierowanych przeciwko grupie genów wybranych do analizy. Procedury te są opisane w wersji tekstowej protokołu.
Komercyjne chipy mikroprzepływowe do kompleksowej analizy QPCR są dostępne w rozmiarach 48 na 48. Format, umożliwiający analizę 48 próbek za pomocą 48 zestawów sond lub w formacie 96 na 96, w którym 96 próbek jest analizowanych za pomocą 96 sond. W większości przypadków wybór chipa zależy przede wszystkim od liczby analizowanych próbek.
Najpierw przygotuj mieszankę próbek zgodnie z chipem wybranym do eksperymentu. Należy zachować ostrożność podczas pipetowania odczynnika do ładowania próbki barwnika wiążącego 20 XDNA. Mieszać roztwory mieszaniny próbek przez co najmniej 20 sekund i odwirowywać przez co najmniej 30 sekund.
Przygotowane reakcje mogą być przechowywane przez krótki czas w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż chip będzie gotowy do załadowania. Następnie przygotuj mieszaninę testową, dokładnie wymieszaj mieszaninę próbek i odwiruj, aby odwirować wszystkie składniki. Jak pokazano wcześniej, układ IFC z dynamiczną matrycą ma wloty dla próbek i testów, a także określone wloty dla płynu z przewodu kontrolnego używanego do zwiększania ciśnienia w komorach mikroprzepływowych.
Najpierw wstrzyknij płyn z przewodu kontrolnego do każdego akumulatora na chipie. Następnie zalej chip, umieszczając go w kontrolerze IFC i uruchamiając odpowiedni skrypt. Po zakończeniu skryptu wyjmij zalany chip ze sterownika IFC i odpipetuj pięć mikrolitrów każdego testu.
Wymieszaj na frytce. Dodaj pięć mikrolitrów każdej mieszanki próbek do ich wlotów i zwróć chip do kontrolera IFC za pomocą oprogramowania kontrolera IFC. Uruchom skrypt, aby załadować próbki i testy do chipa.
Po zakończeniu skryptu load mix wyjmij załadowany chip z kontrolera IFC. Następnie załaduj chip do termocyklera i utwórz nowy przebieg chipa, który obejmuje analizę krzywej topnienia. Korzystając z oprogramowania termocyklera, upewnij się, że komory reakcyjne są prawidłowo rozpoznawane i pozwalają na przebieg reakcji do końca.
Wzrost aktywności lokomotorycznej był widoczny po pojedynczym ostrym wstrzyknięciu kokainy. W tym przekroju koronalnym grube białe linie zaznaczyły położenie nacięć wykonanych w celu wyznaczenia granic jądra półleżącego. Podczas preparacji krzywe amplifikacji starterów skierowane przeciwko CFO i fosom B pokazują, że pary starterów amplifikują swój docelowy transkrypt z około 100% wydajnością.
Wyniki pokazują, że indukowana przez kokainę ekspresja CFO i fosu B w jądrze półleżącym była najwyższa jedną i dwie godziny po ekspozycji. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji, w celu zidentyfikowania nowego, niescharakteryzowanego transkryptu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy manuskrypt opisuje protokół analizy programów transkrypcyjnych w określonych jądrach mózgu gryzoni po zastosowaniu paradygmatów behawioralnych. Podejście to zostało zilustrowane poprzez profilowanie genów indukowanych w jądrze półleżącym (NAc) myszy po ostrej ekspozycji na kokainę.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Analiza behawioralna
- Profilowanie ekspresji genów
Wstęp
- Dynamika transkrypcyjna ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia reakcji mózgu na zachowanie.
- Jądro półleżące jest kluczowym obszarem zaangażowanym w mechanizmy nagrody i uzależnień.
- Ekspozycja na kokainę zmienia ekspresję genów w mózgu.
- Mikroprzepływowe matryce qPCR umożliwiają szczegółowe profilowanie genów.
Cel badania
- Zbadanie zmian transkrypcyjnych w jądrze półleżącym po ekspozycji na kokainę.
- Opracowanie protokołu izolacji RNA i analizy ekspresji genów.
- Zrozumienie wpływu behawioralnego na ekspresję genów u gryzoni.
Zastosowane metody
- Przyzwyczajanie myszy do obchodzenia oraz iniekcji soli fizjologicznej.
- Rejestracja aktywności lokomocyjnej po podaniu kokainy.
- Pobieranie próbek z jądra półleżącego w celu izolacji RNA.
- Analiza QPCR w celu oceny zmian w ekspresji genów.
Główne wyniki
- Obserwowano dynamikę transkrypcyjną po ekspozycji na kokainę.
- Zidentyfikowano specyficzne geny ulegające indukcji w NAc.
- Protokół wykazał skuteczność w profilowaniu ekspresji genów.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia molekularnych podstaw uzależnienia.
Wnioski
- Badanie dostarcza solidnego protokołu analizy ekspresji genów w odpowiedzi na bodźce behawioralne.
- Wyniki poszerzają wiedzę na temat odpowiedzi transkrypcyjnych w badaniach nad uzależnieniami.
- Podejście to można zastosować w innych paradygmatach behawioralnych w neuronauce.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia zespołom badawczo-rozwojowym w sektorze biofarmaceutycznym ilościową ocenę dynamiki transkrypcyjnej w określonych obszarach mózgu po zaburzeniach behawioralnych lub farmakologicznych, co wspiera walidację celów w procesie odkrywania leków neuropsychiatrycznych. Dzięki zapewnieniu powtarzalnych, ilościowych wyników ekspresji genów z ograniczonych próbek tkanek, metoda ta zwiększa pewność predykcyjną we wczesnych badaniach mechanistycznych i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go w przypadku terapeutyków celowanych w OUN. Podejście to jest szczególnie wartościowe w celu minimalizacji ryzyka hipotez związanych z uzależnieniami, szlakami nagrody oraz fenotypami behawioralnymi przed zainwestowaniem zasobów w optymalizację związku wiodącego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie programów transkrypcyjnych w jądrze półleżącym w celu walidacji funkcjonalnego znaczenia genów zaangażowanych w odpowiedzi behawioralne indukowane kokainą.
- Wartość operacyjna: Wspiera rzetelne testowanie hipotez dotyczących celów molekularnych przy użyciu mikrofluidycznego qPCR, co pozwala na wysokoczułe ilościowe określenie zmian w ekspresji genów z ograniczonej ilości tkanki mózgowej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych układów biologicznych do dalszych badań przesiewowych poprzez ustalenie bazowych profili transkrypcyjnych po ostrym wyzwaniu farmakologicznym.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację i powtarzalność testów dzięki ustandaryzowanym procedurom izolacji RNA, odwrotnej transkrypcji oraz mikrofluidycznego qPCR, które można zastosować w wielu próbkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Dostarcza istotnych dla przebiegu choroby odczytów transkrypcyjnych w dobrze opracowanym modelu odpowiedzi na psychostymulanty, co wspiera dopasowanie biomarkerów i redukcję ryzyka mechanistycznego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez dostarczanie ilościowych, multipleksowych danych o ekspresji genów, odpowiednich do potwierdzenia w różnych platformach analitycznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum wczesnego etapu odkrywania leków, wspierając walidację celów opartą na hipotezach oraz opracowywanie testów przed podjęciem wysiłków w celu identyfikacji wiodących związków w programach odkrywania leków ukierunkowanych na ośrodkowy układ nerwowy.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia mechanistyczną analizę dynamiki transkrypcyjnej po doświadczeniu behawioralnym, co wspiera wyjaśnienie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka związanego z doborem celów terapeutycznych.
- Przesiewanie: Generuje ilościowe, multipleksowe wyniki, które zapewniają gotowość i powtarzalność testów w kampaniach przesiewowych związków chemicznych.
- Analityka: Dostarcza znormalizowane pomiary ekspresji genów z mikroprzepływowych macierzy qPCR, umożliwiając statystyczne porównanie różnych warunków eksperymentalnych i punktów czasowych.
- Badania translacyjne: Łączy ostre reakcje behawioralne z sygnaturami molekularnymi w obwodach nagrody, co wspiera trafność translacyjną w modelach uzależnień.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę profilowania transkrypcyjnego możliwą do wielokrotnego wykorzystania w różnych paradygmatach behawioralnych i wyzwaniach farmakologicznych w badaniach nad neuronauką.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych poprzez powiązanie fenotypów behawioralnych z określonymi odpowiedziami transkrypcyjnymi w kluczowych obszarach mózgu.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność analizy ekspresji genów dzięki ustandaryzowanym mikrofluidycznym protokołom qPCR odpowiednim do przetwarzania wielu próbek.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka w przypadku celów w OUN poprzez uzyskanie wglądu w mechanizmy działania przed kosztowną optymalizacją wiodących związków.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów skorygowaną o ryzyko, dostarczając ilościowych dowodów na aktywację ścieżek sygnałowych po podaniu czynnika farmakologicznego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu technik neuronaukowych, w tym testów behawioralnych, sekcji mózgu oraz pracy z RNA.
- Metoda zależy od dostępu do mikrofluidycznych platform qPCR oraz powiązanej aparatury do wysokoprzepustowego profilowania genów.
- Konieczne jest stosowanie zestandaryzowanych protokołów pobierania próbek, izolacji RNA oraz syntezy cDNA w celu zapewnienia spójności między eksperymentami.
- Wymagane są rozważania dotyczące adaptacji protokołu przy jego stosowaniu w odniesieniu do różnych obszarów mózgu, gatunków lub paradygmatów behawioralnych poza odpowiedziami jądra półleżącego indukowanymi kokainą.
- Ograniczenia praktyczne obejmują niską wydajność tkanki z małych jąder mózgu oraz konieczność dokładnej normalizacji w celu uwzględnienia zmienności próbek.
