Stereotaktyczny zabieg chirurgiczny u gryzoni

Chirurgia stereotaktyczna jest potężną techniką wykorzystywaną do manipulacji w mózgu żywych zwierząt. Celowanie w obszary położone głęboko w nienaruszonym mózgu stanowi szczególny problem, ponieważ zazwyczaj celu chirurgicznego nie można zlokalizować wizualnie. Stereotaksja, czyli chirurgia stereotaktyczna, została opracowana w celu precyzyjnego dotarcia do konkretnych obszarów mózgu poprzez wyznaczenie ich relacji przestrzennych względem widocznych punktów orientacyjnych. Dzięki zastosowaniu trójwymiarowego układu współrzędnych narzędzia mogą być kierowane w określone miejsca w celu pomiaru aktywności mózgu, wykonania uszkodzenia (lezji) lub przeprowadzenia manipulacji genetycznych. Niniejszy film omówi zasady chirurgii stereotaktycznej, zaprezentuje kluczowe etapy procedury oraz przedstawi różne zastosowania tej techniki.

Zanim przejdziemy do szczegółów procedury, przejrzyjmy podstawowe zasady i narzędzia tej techniki. Na początek, stereotaksja opiera się na lokalizacji docelowego regionu mózgu w układzie trójwymiarowym. W tym celu stosuje się atlas stereotaktyczny. Dokument ten stanowi rekonstrukcję 3D mózgu, uzyskaną z seryjnych przekrojów barwionych mózgów.

W tym układzie odniesienia relacje przestrzenne są wyrażone za pomocą zestawu 3 osi: przednio-tylnej, przyśrodkowo-bocznej oraz grzbietowo-brzusznej. Aby określić położenie obszaru zainteresowania, należy odnaleźć odpowiedni region mózgu w atlasie i skorzystać z siatki, aby obliczyć odpowiadające mu współrzędne przyśrodkowo-boczne i grzbietowo-brzuszne. Współrzędną przednio-tylną odczytuje się na dole lub u góry strony. Współrzędna ta jest mierzona od punktów orientacyjnych na czaszce, utworzonych przez przecięcia blaszek kostnych, znanych jako szwy. Najważniejszy punkt orientacyjny, bregma, definiuje się jako punkt przecięcia szwu strzałkowego z szwem czołowym. Punkt znany jako lambda znajduje się bardziej posterioralnie, w miejscu, gdzie szew strzałkowy przecina się z szwem łyżkowatym.

W celu precyzyjnego trafienia w obliczoną lokalizację podczas operacji stosuje się urządzenie zwane ramą stereotaktyczną. Rama składa się z konstrukcji głównej, mikromanipulatora oraz uchwytu sondy, który jest przymocowany do zacisku montażowego. Przymruchy do siekaczy i pręty uszne stykają się z zwierzęciem, aby utrzymać głowę w stałej pozycji. Mikromanipulator służy do precyzyjnego przemieszczania sond chirurgicznych do określonych współrzędnych wewnątrz mózgu i jest wyposażony w przesuwne noniusze do dokładnych pomiarów odległości we wszystkich trzech wymiarach.

Aby odczytać wartość z noniusza, należy najpierw zidentyfikować położenie linii 0 w stosunku do kresek po prawej stronie skali. Ta strona skali jest opisana w interwałach 10 mm, zatem 1 oznacza 10, a 2 oznacza 20. Położenie znaku 0 wskazuje tutaj, że odczyt znajduje się pomiędzy 10 a 11 mm. Aby określić pierwszą cyfrę po przecinku, należy znaleźć linię na lewej skali, która najlepiej pokrywa się z kreską po prawej stronie. Użyj lewej skali, aby zidentyfikować wartość tej kreski, którą w tym przypadku jest 9, co daje końcowy odczyt 10,9 mm.

Znasz już podstawowe zasady stereotaksji, zatem przejrzyjmy, jak przebiega procedura chirurgiczna. Przed operacją skórę głowy zanestezjowanego zwierzęcia należy ogolić i zdezynfekować. Aby unieruchomić zwierzę w ramie stereotaksycznej, delikatnie umieszcza się pręty uszne w uszach, a przednie zęby w prętach do siekaczy. W celu zapobiegania wysychaniu rogówki podczas operacji stosuje się maść do oczu.

Aby odsłonić czaszkę, należy wykonać skalpelem niewielkie nacięcie. Delikatnie odseparuj tkankę mięśniową i oczyść powierzchnię czaszki. Następnie, za pomocą mikromanipulatora, opuść sondę na punkt bregma i zanotuj jego współrzędną grzbietowo-brzuszną. Następnie podnieś sondę i powtórz tę procedurę w punkcie lambda. Jeśli pomiar w punkcie lambda różni się o mniej niż 0,1 mm od współrzędnej grzbietowo-brzusznej w punkcie bregma, czaszka jest uznawana za wypoziomowaną i można przejść do kolejnego etapu. W przeciwnym razie podnieś lub obniż pręt do siekaczy i powtórz pomiary.

Po wypoziomowaniu mózgu wróć do punktu bregma i zapisz współrzędne boczno-środkowe oraz przednio-tylne. Na podstawie współrzędnych celu z atlasu mózgu oblicz ruchy niezbędne do dotarcia do tego miejsca i przesuń sondę do pozycji docelowej. Zaznacz tę pozycję na czaszce i za pomocą wiertarki ostrożnie wykonaj otwór w kości.

Bezpośrednio pod czaszką znajduje się ostoń – gruba, wytrzymała błona, którą można delikatnie przeciąć końcówką małej igły.

Następnie ramię mikromanipulatora ustawia się w pozycji umożliwiającej opuszczenie sondy do docelowej współrzędnej grzbietowo-brzusznej, po czym można przeprowadzić pożądaną manipulację.

Po zapoznaniu się z podstawowymi krokami procedury, przyjrzyjmy się kilku z wielu sposobów, w jakie neurobiolodzy wykorzystują chirurgię stereotaktyczną do odpowiadania na pytania badawcze w laboratorium.

Na początek, stereotaksja jest niezwykle użyteczna przy wprowadzaniu czynników eksperymentalnych do precyzyjnie określonych obszarów mózgu. Czynniki te mogą obejmować barwniki śledzące stosowane do wizualizacji projekcji neuronalnych i łączności, związki chemiczne lub odczynniki do manipulacji genetycznej neuronów. Na przykład wstrzyknięcie genetycznie zmodyfikowanych wirusów pozwoli na dostarczenie interesującego genu do zakażonych komórek. W tym przypadku wirus został wstrzyknięty do hipokampa, co doprowadziło do ekspresji GFP w niewielkiej populacji neuronów.

Z drugiej strony, wirusowe dostarczanie krótkich interferujących RNA może zapobiec ekspresji pożądanych białek. W tym przykładzie ekspresja białka SOD1 została zahamowana w różnych obszarach mózgu po wstrzyknięciu stereotaktycznym do komory bocznej.

Alternatywnie, chirurgię stereotaktyczną można wykorzystać do umieszczenia elektrod w mózgu w celu rejestracji sygnałów elektrycznych towarzyszących aktywności neuronalnej. Po powrocie zwierzęcia do sprawności po zabiegu chirurgicznym, elektrody można podłączyć do systemów rejestracji elektrofizjologicznej, aby obserwować wyładowania neuronalne podczas swobodnego zachowania myszy.

Oprócz pomiaru aktywności neuronalnej, chirurgia stereotaktyczna jest niezbędna do przeprowadzania mikrodializy. Technika ta umożliwia ciągłe monitorowanie stężeń leków, neuroprzekaźników lub metabolitów w tkance mózgowej u budzących się zwierząt. Aby to osiągnąć, do konkretnego obszaru mózgu implantuje się małą, wypełnioną cieczą sondę z półprzepuszczalną membraną na końcówce. Małe substancje rozpuszczone, w tym neuroprzekaźniki, hormony i leki, dyfundują do sondy, skąd mogą być zbierane do analizy. W tym eksperymencie stężenie glukozy w hipokampie było mierzone jako wskaźnik lokalnej aktywności neuronalnej podczas wykonywania przez szczury zadania wymagającego wykorzystania przestrzennej pamięci roboczej.

Właśnie obejrzeli Państwo film JoVE na temat chirurgii stereotaktycznej. W tym materiale omówiliśmy zasady i metody tej procedury, a także jej liczne zastosowania w laboratoriach neuronaukowych.

Dziękujemy za uwagę!