Regioselektywne celowanie biolistyczne w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu zmodyfikowanego pistoletu genowego
24 października 2014
Ostatnie ulepszenia w organotypowych preparatach do wycinania mózgu pozwoliły na ich wykorzystanie do zastosowań biotechnologicznych. Plastry organotypowe zachowują lokalne cechy strukturalne biologii in vivo, w tym funkcjonalne połączenia synaptyczne. Tutaj przedstawiamy regioselektywną biolistyczną metodę dostarczania do znakowania i genetycznej manipulacji tymi wycinkami.
Celem tej procedury jest szybkie i skuteczne transfekowanie lub znakowanie odrębnych regionów wycinków organotypowych za pomocą pistoletu genowego. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw żywotnych organotypowych wycinków mózgu lub innych tkanek. Drugim krokiem jest wyprodukowanie DNA lub zdekodowanych cząsteczek złota w celu dostarczenia biotycznego.
Następnie wycinek organotypowy umieszcza się pod ustabilizowanym uchwytem pistoletu genowego, a powlekane cząstki są wystrzeliwane do tkanki lub transformacji episomalnej lub znakowania. Ostatnim krokiem jest obserwacja lub analiza wpływu heterologicznych genów dostarczanych do izolowanych regionów. Ostatecznie takie podejście pozwala użytkownikowi na precyzyjną transfekcję różnych regionów wycinków narządu z różnymi heterologicznymi genami.
Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że biologistyka pozwala na transfekcję terminalnie różnicujących się komórek, a także ogranicza promień działania do małej średnicy. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu kluczowych zagadnień neurobiologicznych, takich jak zrozumienie regionalnego wkładu pojedynczego genu. Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia świeżego mózgu w małej foremce biorcy.
Przykryj go roztworem ARO, który został wezwany do temperatury nieco wyższej niż pokojowa. Następnie szybko schłodzić formę do czterech stopni Celsjusza, umieszczając ją na lodzie. Gdy aros zostanie ustawiony.
Po pięciu do 10 minutach wyjmij osadzony mózg aros z formy. Następnie przyklej go do platformy krajalnicy fibro. Następnie przenieś platformę do komory krajalnicy Vibra zawierającej sterylny, lodowaty PBS.
Po pokrojeniu w plastry delikatnie umieść plastry na wkładkach do hodowli komórkowych na sześciodołkowej tacy z pożywką hodowlaną na zewnątrz wkładki. Inkubuj je w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. W tej procedurze przygotuj nano pociski przy użyciu cząstek złota o średnicy 40 nanometrów, dodając najpierw 50 mikrolitrów 0,05 molowej spermy i 10 mikrolitrów DNA w ilości jednego miligrama na mililitr do 10 miligramów cząstek złota.
Następnie dodaj chlorek wapnia do mieszaniny roztworów, aby wspomóc wiązanie cząsteczek DNA z nanocząstkami złota. Następnie pobrać roztwór do rurki za pomocą strzykawki. Umieść rurkę w stacji przygotowania przewodów.
Pozwól, aby cząsteczki złota opadły. Następnie usuń supinat przez aspirację Za pomocą strzykawki. Obróć rurkę, aby równomiernie rozprowadzić cząsteczki złota.
Następnie wysusz cząstki przy stałym przepływie azotu z prędkością pięciu litrów na minutę. Aby stworzyć kulki DNA, pokrój rurkę na jednocentymetrowe kawałki za pomocą obcinaka do rurek. Następnie albo włóż je natychmiast do wkładu z genem wyhodowanym, albo trzymaj je wysuszone w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia w sterylnym kapturze z przepływem blaszki, załaduj wkład zawierający złoto pokryte DNA do uchwytu wkładu.
Następnie załaduj uchwyt do pistoletu genowego. Przymocuj do niego zmodyfikowaną lufę pistoletu genowego za pomocą sterylnych kleszczy. Umieść wkład filtrujący zawierający plasterek organotypowy w sterylnym plastikowym naczyniu.
Usunąć pożywkę z plastra organotypowego. Następnie ustaw ciśnienie gazu na 50 PSI za pomocą uchwytu. Umieść pistolet genowy w odległości 10 milimetrów powyżej żądanego obszaru plasterka w celu dostarczenia genetyki.
Następnie ostrożnie wyceluj w środek lufy i wystrzel powlekane cząstki w tkankę. Po transfekcji biotycznej delikatnie umyj plasterek dwa razy za pomocą PBS. Następnie utrwal plasterek, inkubując w 4% lodowatym PFA w PBS przez 20 minut.
Następnie umyj plasterek dwukrotnie w PBS. Ponownie delikatnie odetnij membranę od wkładu za pomocą skalpela, nie naruszając plastra. Następnie umieść wspornik membrany na szkiełku mikroskopowym z kleszczami i pozwól, aby plasterek organotypowy spoczęł na nim.
Następnie dodaj jedną kroplę nośnika montażowego na plasterek. Umieść szkiełko nakrywkowe delikatnie, bez użycia siły, bezpośrednio stykając się z tkanką. Następnie zabezpiecz szkiełko nakrywkowe cienką warstwą lakieru do paznokci.
Rysunek ten pokazuje biotyczne dostarczanie fluorescencyjnego DNA zakodowanego w białku do organotypowego wycinka sześciotygodniowej myszy. Jak widać tutaj, neuron bikini z niezwykłym portem dendrytycznym znajdującym się na styku warstwy bikini i warstwy molekularnej móżdżku wykazuje wyraźne znakowanie po przejściowej transfekcji biotycznej z P-E-G-F-P-N one. Tutaj jest większe powiększenie dendrytów z kolcami, a tutaj jest komórka parametaliczna znajdująca się w regionie hipokampa.
Po biotycznym dostarczeniu nanocząstki złota pokrytej czerwoną powłoką PDS FP Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu zaledwie kilku godzin w ciągu trzech do czterech dni po tej procedurze. Inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób niektóre neurony są połączone z sąsiednimi regionami.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę regioselektywnego dostarczania biolistycznego w celu znakowania i genetycznej manipulacji organotypowymi skrawkami mózgu. Technika ta pozwala na precyzyjną transfekcję określonych obszarów, zachowując cechy in vivo skrawków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biotechnologia
- Manipulacje genetyczne
Wstęp
- Organotypowe skrawki mózgu zachowują lokalne cechy strukturalne biologii in vivo.
- Ostatnie postępy zwiększyły zakres ich zastosowania w badaniach.
- Zrozumienie funkcji genów w konkretnych obszarach mózgu jest kluczowe dla studiów neurobiologicznych.
- Tradycyjne metody transfekcji mogą nie celować w konkretne obszary w sposób efektywny.
Cel badania
- Opracowanie metody ukierunkowanej manipulacji genetycznej w skrawkach mózgu.
- Zbadanie regionalnego wpływu konkretnych genów w neurobiologii.
- Poprawa wydajności transfekcji komórek terminalnie zróżnicowanych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie organotypowych skrawków mózgu przy użyciu fibro slicera.
- Produkcja nanocząsteczek złota powlekanych DNA do dostarczania biotycznego.
- Wykorzystanie armatki genowej do precyzyjnej transfekcji.
- Obserwacja efektów transfekcji przy użyciu mikroskopii.
Główne wyniki
- Skuteczne znakowanie odrębnych regionów w skrawkach organotypowych.
- Wykazanie efektywnej transfekcji w komórkach terminalnie zróżnicowanych.
- Wizualizacja struktur neuronalnych po transfekcji.
- Potencjalne zastosowania w badaniu funkcji genów w neurobiologii.
Wnioski
- Metoda dostarczania biolistycznego jest potężnym narzędziem do manipulacji genetycznych.
- Technika ta może pogłębić zrozumienie procesów neurobiologicznych.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę w różnych zastosowaniach badawczych.
Często zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Regioselektywne celowanie biolistyczne w organotypowych skrawkach mózgu umożliwia precyzyjną manipulację genetyczną określonych obszarów neuronalnych, co wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka oraz walidację celów w neurobiologii. Podejście to rozwiązuje problem transfekcji terminalnie zróżnicowanych neuronów, zapewniając pewność prognostyczną w fazie wczesnego odkrywania oraz genomiki funkcjonalnej. Zdolność do lokalnego dostarczania genów usprawnia podejmowanie decyzji w zarządzaniu portfolio poprzez wyjaśnienie regionalnych efektów działania genów w złożonych systemach tkankowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie funkcji genów w anatomicznie określonych obszarach mózgu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez izolowanie regionalnych efektów genów heterologicznych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów w obwodach neuronalnych istotnych dla przebiegu choroby.
- Zwiększa pewność prognostyczną dla dalszych strategii neuroterapeutycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje walidowane układy organotypowe do ilościowej analizy efektów genowych.
- Zwiększa powtarzalność i standaryzację dzięki kontrolowanemu dostarczaniu cząstek.
- Wspiera skalowalne i szybkie przepływy pracy w transfekcji dla zastosowań przesiewowych.
- Umożliwia wiarygodną ocenę konstruktów genowych w tkankach o znaczeniu fizjologicznym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami istotnymi dla przebiegu chorób dzięki zachowaniu architektury tkankowej zbliżonej do warunków in vivo.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej w układach neuronalnych.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne, umożliwiając regionowo swoistą manipulację genami.
- Wspiera opracowywanie biomarkerów poprzez analizę ekspresji lokalnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta regioselektywna metoda biolistyczna integruje się z kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, łącząc wczesną genomikę funkcjonalną z translacyjnymi przepływami pracy w neuronauce.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w określonych obszarach neuronalnych.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki transfekcji do badań porównawczych.
- Analityka: Umożliwia pomiar lokalnej ekspresji genów i wyników fenotypowych.
- Badania translacyjne: Zachowuje kontekst tkankowy dla przedklinicznych badań nad biomarkerami i skutecznością.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku dla różnorodnych zastosowań w dostarczaniu genów i znakowaniu w systemach organotypowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów neuronalnych.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje procesy transfekcji dzięki poprawie powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji go/no-go poprzez wyjaśnienie regionalnych efektów genów w złożonych tkankach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i konstruktów neurobiologicznych z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowywaniu organotypowych skrawków oraz w dostarczaniu materiału metodą biolistyki.
- Wymaga dostępu do zmodyfikowanego sprzętu do transfekcji genowej (gene gun) oraz sterylnych warunków hodowli.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu uzyskania powtarzalnych parametrów transfekcji.
- Możliwość adaptacji do różnych obszarów mózgu i typów tkanek po optymalizacji protokołu.
- Ograniczone rozdzielczości przestrzennej i głębokości penetracji cząstek, zdefiniowane przez zmodyfikowaną komorę.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:21
Preparation of Organotypic Slices
2:20
Preparation of DNA-coated Micro & Nano-projectiles
3:38
Biolistic Transfection on Organotypic Slices
4:29
Fixing and Visualization of Brain Slices
5:24
Results: Biolistic Delivery of Fluorescent Protein Encoded DNA into Organotypic Slices
6:12
Conclusion
