Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pokazanie, w jaki sposób połączenia synaptyczne między morfologicznie zidentyfikowanymi neuronami są scharakteryzowane zarówno funkcjonalnie, jak i strukturalnie. Osiąga się to poprzez uzyskanie ostrych wycinków mózgu, które są zoptymalizowane pod kątem badania określonego połączenia synaptycznego. Zaciskanie łat jest następnie wykorzystywane do testowania neuronów sprzężonych synaptycznie.

W tym celu łata się pojedynczy potencjalny neuron postsynaptyczny, a następnie używa się drugiej pipety do stymulacji otaczających neuronów w celu ustalenia istnienia połączenia synaptycznego. Jeśli nie widać żadnej odpowiedzi, elektroda stymulująca jest przesuwana. Po znalezieniu połączenia neuron presynaptyczny jest ponownie dopasowywany w trybie hurtowym.

Po zapisach elektrofizjologicznych z tych neuronów i jednoczesnym wypełnieniu biotyną, wycinek jest utrwalany, przetwarzany na biotynę i wykonywana jest wspomagana komputerowo rekonstrukcja 3D neuronów. Ostatecznie nasza metoda ma na celu skorelowaną ilościową analizę strukturalną i funkcjonalną mikroukładów neuronalnych. Główną zaletą sparowanych nagrań z neuronów sprzężonych synaptycznie jest to, że możemy przeprowadzić skorelowaną analizę strukturalną i funkcjonalną zarówno neuronów pre, jak i postsynaptycznych w mikroobwodach neuronalnych.

Jeszcze niedawno wprowadzone techniki, takie jak optyczna stymulacja neuronów, nie są do tej pory w stanie osiągnąć tego z tak dużą ilością szczegółów. Metoda ta umożliwia badanie interakcji pobudzenia i hamowania morfologicznie zidentyfikowanych typów neuronów oraz sposobu modulacji aktywności. Demonstracją procedur dla nagrań zwierząt domowych będzie Guan.

Ten, który jest doktorem habilitowanym w moim laboratorium. Po przygotowaniu plastrów obszaru docelowego, pozwól im inkubować w tym czasie, pociągnij pipety do plastrów, które powinny mieć długi i smukły trzonek. Po zabezpieczeniu wycinka mózgu za pomocą harfy platynowej w komorze eksperymentalnej, napełnij pipetę rejestracyjną roztworem wewnętrznym.

Umieść pipetę w przedwzmacniaczu i załataj przypuszczalny neuron postsynaptyczny w trybie całej komórki za pomocą pipety do przeszukiwania o rezystancji od 8 do 10 megaomów, wypełnionej wewnętrznym roztworem, w którym sole potasu są zastępowane solami sodu. Zastosuj delikatne ssanie do pipety poszukiwawczej, aby załatać potencjalny neuron presynaptyczny w luźnej komórce. Dołączona konfiguracja.

Utrzymuj potencjał membrany pod luźnym uszczelnieniem na poziomie od minus 30 do minus 60 miliwoltów w obecnym trybie clamp. Następnie zastosuj duże impulsy prądowe od 0,2 do dwóch nanoamperów, aby wywołać potencjał czynnościowy w potencjalnej komórce presynaptycznej. Obserwuj ten potencjał czynnościowy jako mały kłosek na odpowiedzi napięciowej.

Ustaw częstotliwość stymulacji na 0,1 herca, aby zapobiec wyczerpaniu odpowiedzi postsynaptycznej. Jeśli neuron postsynaptyczny nie reaguje na stymulację badanego potencjalnie presynaptycznego neuronu plamowego, nowy potencjalny neuron presynaptyczny w trybie luźnego uszczelnienia. Przetestuj w ten sposób do 30 potencjalnie presynaptycznych neuronów.

Dalsze stosowanie tej samej elektrody krosowej do wyszukiwania, o ile można ustalić uszczelnienie o rezystancji większej niż 30 megaomów. Jeśli stymulacja w trybie luźnego uszczelnienia powoduje EPSP lub IPSP z opóźnieniem mniejszym niż pięć milisekund w neuronie postsynaptycznym, wyjmij pipetę przeszukującą z neuronu presynaptycznego za pomocą elektrody rejestrującej wypełnionej biotyną zawierającą zwykły roztwór wewnętrzny o rezystancji od czterech do ośmiu megaomów. Załataj neuron presynaptyczny i nagrywaj w trybie cęgowania prądu całej komórki.

Wywołaj potencjały czynnościowe przez wstrzyknięcie prądu do neuronów presynaptycznych i zarejestruj odpowiedź postsynaptyczną. Przechowuj dane na komputerze w celu późniejszej analizy w trybie offline. Przez cały czas trwania nagrania biotyna dyfunduje do neuronu, aby uzyskać odpowiednie zabarwienie.

Pozwól biotynie dyfundować przez co najmniej 15 do 30 minut, w zależności od wielkości neuronu. W przypadku mikroukładów neuronalnych o wysokim współczynniku łączności nie stosuje się elektrody poszukiwawczej. Zacznij raczej od bezpośredniego załatania neuronu presynaptycznego w trybie całej komórki.

Następnie, za pomocą elektrody łatkowej wypełnionej zwykłym roztworem wewnętrznym, nałataj potencjalny neuron postsynaptyczny również w trybie całej komórki, obie komórki powinny być pod kontrolą obecnego zacisku. Wywołaj potencjał czynnościowy w komórce presynaptycznej i monitoruj potencjalny neuron postsynaptyczny pod kątem potencjału postsynaptycznego. Jeśli neuron nie wykazuje odpowiedzi na stymulację presynaptyczną, użyj nowej elektrody, aby ponownie załatać nowy neuron w trybie całej komórki.

Po znalezieniu połączenia kontynuuj nagrywanie, jak pokazano wcześniej, bez wymiany pipety krosowej. Po zamocowaniu i zamontowaniu plastrów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, zbadaj neurony znakowane biotyną pod mikroskopem świetlnym. Upewnij się, że pałki aksonalne i kolce dendrytyczne są wyraźnie widoczne.

Korzystając z komercyjnego systemu śledzenia neuronów, ręcznie śledź neurony lub pary neuronów sprzężonych synaptycznie. Pamiętaj, aby uwzględnić nawet małe zabezpieczenia aksonalne lub dendrytyczne. Użyj śladów, aby uzyskać rekonstrukcje neuronów 3D, skoryguj rekonstrukcje neuronów pod kątem skurczu we wszystkich trzech wymiarach przestrzennych w odpowiedniej sekcji programu śledzącego.

Współczynniki korekcji skurczu dla medium do zatapiania wynoszą około 1,1 dla kierunków x i y oraz około 2,1 dla kierunku Z. Wzajemnie sprzężona para komórek składająca się z kolczastego gwiaździsty i szybko wskakującego do neuronu. W warstwie korowej cztery wypełniono biotyną.

Podczas nagrywania zielone kropki wskazują na domniemane pobudzające kontakty synaptyczne między presynaptycznym neuronem kolczastym a postsynaptycznym neuronem inter. Niebieskie kropki wskazują przypuszczalne wzajemne hamujące kontakty synaptyczne. Obrazy o dużej mocy kontaktów synaptycznych są pokazane tutaj.

Zielone otwarte kręgi pokazują kontakty pobudzające, a niebieskie otwarte kółka pokazują kontakty hamujące. Neuroklarowna rekonstrukcja tej wzajemnie połączonej pary komórek jest pokazana tutaj. Akson między neuronami jest pokazany na niebiesko, a jego soma i dendryt są pokazane na czerwono.

Akson neuronów kolczastych jest pokazany na zielono, a jego soma i dite są na biało. Wstawka pokazuje przedziały dendrytyczne somato neuronów pre i postsynaptycznych. Wraz z domniemanymi kontaktami synaptycznymi, kontury beczki zostały zidentyfikowane na mikrofotografiach o niskiej mocy w jasnym polu wykonanych z ostrego wycinka mózgu.

Reprezentatywne połączenie synaptyczne o bardzo niskim współczynniku łączności jest pokazane tutaj. Presynaptyczny potencjał czynnościowy w komórce parametalowej warstwy szóstej wywołał monosynaptyczny pobudzający potencjał postsynaptyczny w neuronach parametalicznych warstwy czwartej. Pokazane tutaj opóźnienie wynoszące ponad trzy milisekundy tego trans laminarnego połączenia jest znacznie dłuższe niż około jednego milisekundy opóźnienia obserwowane w lokalnych połączeniach wewnątrzlaminarnych.

Dwa potencjały czynnościowe o częstotliwości 10 Hz wywołane w komórce parametalowej warstwy szóstej wyzwały potencjały postsynaptyczne w pokazanym tutaj neuronie parametalicznym z warstwy czwartej. Zwróć uwagę na krótkoterminowe ułatwienia. Ważne jest, aby pamiętać, że warunek cięcia musi być zoptymalizowany dla danego połączenia synaptycznego, a podczas nagrywania konfiguracja musi być absolutnie stabilna, a następnie gwarantowane jest optymalne zrozumienie nagrywania.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób pomiary elektrofizjologiczne i rekonstrukcje morfologiczne są wykorzystywane do uzyskania ogólnego obrazu strukturalnych i funkcjonalnych właściwości mikroobwodów neuronalnych w korze nowej.