Test kolorymetryczny, który specyficznie mierzy aktywność proteolityczną Granzyme B: hydroliza Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
28 listopada 2014
Opisujemy prosty, ilościowy test kolorymetryczny, który konkretnie mierzy aktywność proteolityczną ludzkiego, mysiego lub szczurzego Granzyme B (GzmB). Protokół ten można łatwo dostosować do określania aktywności proteazy innych granulowanych proteaz serynowych poprzez hydrolizę innych syntetycznych substratów peptydowych z odpowiednią sekwencją rozpoznawania.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zmierzenie aktywności proteolitycznej proteazy granzymu B. Osiąga się to poprzez przygotowanie lizatu komórek będących przedmiotem zainteresowania, a następnie szybkie dodanie substratu do próbek. Aktywność granzymu B jest następnie mierzona za pomocą reakcji kolorymetrycznej. Ostatecznie, wysoce specyficzne rozszczepienie alla alla as s benzo przez granzyme B można ocenić na podstawie jego unikalnej specyficzności substratowej dla reszt kwasu spart.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak wykrywanie ekspresji wielkiej strefy B za pomocą PCR lub Western blot, jest to, że hydroliza benzylu jest specyficzna dla wielkiej strefy B, a także wskazuje, że proteaza jest aktywna. Aby przygotować komórkę, lizaty najpierw izolują pierwotne komórki NK z zawiesin pojedynczych komórek śledziony z dzikiej czarnej szóstki typu C 57 lub kontrolują myszy zero genu granzyme B przez selekcję negatywną przy użyciu dostępnych na rynku zestawów zgodnie z instrukcjami producenta po aktywacji komórek. Przemyć kulturę trzykrotnie w PBS z maksymalną prędkością przez dwie do trzech sekund, a następnie ponownie zawiesić osad zawierający co najmniej 5 milionów komórek NK w 100 mikrolitrach buforu do lizy Nont P 40 na lodzie przez 20 minut.
Następnie odwirować lizat w mikrowirówce przez 10 minut w temperaturze 15 000 G i przenieść środek leżący na wznak do świeżej probówki. Po określeniu stężenia białka, zgodnie z odpowiednim dostępnym na rynku protokołem, należy przechowywać sat w stężeniu co najmniej około dwóch miligramów na mililitr w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w celu przeprowadzenia testu aktywności wielkiego zymu B. Następnie rozcieńczyć co najmniej 100 mikrogramów lizatu białkowego na próbkę w świeżo przygotowanym buforze pryzmy do końcowej objętości 160 mikrolitrów.
Następnie za pomocą pipety wielokanałowej załaduj 50 mikrolitrów próbki na studzienkę w trzech egzemplarzach do 96-dołkowej winylowej płyty dolnej w kształcie litery U. Zwracając uwagę na dołączenie trzech studzienek kontrolnych tylko z buforem, do każdej z nich dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonego DTNB. Cóż, następnie szybko dodaj 50 mikrolitrów świeżo rozcieńczonego substratu benzoilowego alala prosi s o substrat benzoilowy do każdej z samych studzienek buforowych hałd, a następnie wszelkie kontrole ujemne i kończąc z oczekiwanymi próbkami pozytywnymi.
Zmierzyć aktywność aazy przez hydrolizę alala jako benzylu w czytniku mikropłytek o gęstości optycznej 405 nanometrów przy użyciu protokołu testu kinetycznego wykonującego 25 odczytów co 15 sekund. Na koniec użyj oprogramowania czytnika płytek, aby obliczyć maksymalną szybkość rozszczepienia substratu dla każdej studzienki, a następnie przenieś surowe dane do odpowiedniego oprogramowania do analizy statystycznej przy użyciu myszy z nokautem genu granzyme. Odkryto, że syntetyczny substrat peptydowy alala jako benzyl jest specyficznie hydrolizowany przez granzym B. Dalsze solidne rozszczepienie syntetycznego substratu można zmierzyć w lizatach komórkowych z pierwotnych komórek NK typu dzikiego, ale nie w komórkach NK od zwierząt z nokautem granzymu B jako kontrola.
W tym eksperymencie aktywność proteolityczna granzymu A, który ma specyficzność substratową podobną do tripsyny i jest obecny w lizatach z obu typów komórek, była równa, mierzona przez hydrolizę benzylu BLT, I-E-P-D-P-N-A została użyta ogólnie do testowania aktywności granzymu B u różnych gatunków. W tym reprezentatywnym eksperymencie analiza sekwencji tetrapeptydowych wykazała, że ludzki, ale nie mysi granzym B, może skutecznie rozszczepiać się po sekwencji IEPD, która odpowiada sekwencji rozpoznawania zarówno u ludzi, jak i myszy. W przeciwieństwie do tego, zmniejszenie ilości lizatu ludzkich komórek białaczki NK z 30 mikrogramów do 10 mikrogramów nadal skutkuje wystarczającą ilością gramowego enzymu B do hydrolizy substratu I-E-P-D-P-N-A.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wybrać odpowiedni substrat i eksperymentalne kontrole do analizy in vitro czerwonego ludzkiego i mysiego enzymu B.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia ilościowy test kolorymetryczny służący do pomiaru aktywności proteolitycznej Granzymu B (GzmB) w próbkach pochodzących od ludzi, myszy lub szczurów. Metodę tę można dostosować do innych serynowych proteaz ziarnistych, stosując odpowiednie syntetyczne substraty peptydowe.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Aktywność proteaz
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Granzym B jest serynową proteazą zaangażowaną w odpowiedzi immunologiczne.
- Pomiar jego aktywności jest kluczowy dla zrozumienia jego roli w cytotoksyczności komórkowej.
- Istniejące metody, takie jak PCR czy Western blot, nie mierzą bezpośrednio aktywności proteazy.
- Niniejszy test zapewnia specyficzny i bezpośredni pomiar aktywności GzmB.
Cel badania
- Opracowanie prostego testu do ilościowego oznaczenia aktywności GzmB.
- Przedstawienie metody, która może zostać dostosowana do innych proteaz.
- Udoskonalenie istniejących technik poprzez zapewnienie specyficzności względem aktywności GzmB.
Stosowane metody
- Przygotowanie lizatów komórkowych z pierwotnych komórek NK.
- Wykorzystanie reakcji kolorymetrycznej do pomiaru aktywności GzmB.
- Izolacja komórek NK ze śledzion modeli myszy typu dzikiego oraz myszy z knock-outem genu granzymu B.
- Hydroliza substratu w celu oceny aktywności proteazy.
Główne wyniki
- Test skutecznie mierzy aktywność GzmB poprzez specyficzne rozszczepienie substratu.
- Wykazuje on wysoką specyficzność wobec GzmB w porównaniu z innymi metodami.
- Wyniki wskazują na aktywność proteazy na podstawie hydrolizy substratu.
- Metoda ta jest możliwa do zaadaptowania dla innych serynowych proteaz ziarnistych.
Wnioski
- Opracowany test jest niezawodnym narzędziem do pomiaru aktywności GzmB.
- Oferuje on zalety w porównaniu z tradycyjnymi metodami dzięki bezpośredniej ocenie funkcji proteazy.
- Podejście to może usprawnić badania nad odpowiedziami immunologicznymi i biologią proteaz.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Dokładny pomiar aktywności proteolitycznej granzymu B jest niezbędny do walidacji funkcji limfocytów cytotoksycznych w rozwoju immunoterapii. Ten test kolorymetryczny zapewnia bezpośredni i specyficzny odczyt aktywności proteazy, co umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka w zakresie angażowania celu oraz potencjału proapoptotycznego w modelach przedklinicznych. Jego kompatybilność międzygatunkowa wspiera ciągłość translacyjną z badań na gryzoniach do zastosowań u ludzi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie szlaków apoptozy zależnej od granzymu B w limfocytach cytotoksycznych.
- Wartość operacyjna: Pozwala odróżnić aktywną proteazę od samej ekspresji, co redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich podczas walidacji celu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera funkcjonalne potwierdzenie roli granzymu B jako mechanistycznego czynnika napędzającego odpornościowe usuwanie nowotworu.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Wykorzystuje substrat Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl hydrolizowany wyłącznie przez Granzyme B w układach ludzkich, mysich i szczurzych.
- Wynik ilościowy: Pomiar początkowych szybkości hydrolizy za pomocą reakcji kolorymetrycznej sprzężonej z DTNB przy 405 nm do analizy kinetycznej.
- Kontrola specyficzności: Wyklucza interferencję kaspaz i innych granzymów dzięki unikalnej preferencji do asparaginianu.
- Powtarzalność: Kompatybilny z niefrakcjonowanymi lizatami i proteazami rekombinowanymi przy zastosowaniu odpowiednich kontroli.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście chorób: Możliwość zastosowania w modelach nadzoru immunologicznego nad nowotworami, infekcjach wirusowych oraz patologiach autoimmunologicznych, w których Granzyme B pośredniczy w śmierci komórki docelowej.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia spójny pomiar aktywności u różnych gatunków, co wspiera ekstrapolację danych z modelu mysiego na ludzki.
- Decyzje z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza biomarkera opartego na aktywności, który pozwala na priorytetyzację kandydatów o potwierdzonym potencjale cytotoksycznym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację wiodących związków, w którym funkcjonalna aktywność proteazy dostarcza informacji o skuteczności biologicznej i mechanizmie działania.
- Biologia odkrywcza: Potwierdza hipotezę, że Granzyme B indukuje apoptozę w limfocytach efektorowych poprzez specyficzne dla substratu cięcie.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, ilościowych odczytów aktywności do porównywania warunków lub perturbacji genetycznych.
- Analityka: Generuje dane kinetyczne (Vmax), umożliwiające porównywanie próbek i statystyczną ocenę zdolności proteolitycznej.
- Badania translacyjne: Wspiera walidację przedkliniczną poprzez weryfikację zachowanej aktywności Granzyme B u ludzi, myszy i szczurów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Platforma możliwa do adaptacji do innych proteaz ziarnistych poprzez zamianę substratu, co zwiększa długoterminową użyteczność.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Bezpośredni pomiar funkcji proteolitycznej zmniejsza zależność od markerów zastępczych, takich jak poziomy mRNA lub białek.
- Wartość operacyjna: Prosty format oparty na płytkach, minimalny czas pracy manualnej oraz kompatybilność ze standardowymi czytnikami mikropłytek.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o aktywność funkcjonalną, a nie tylko ekspresję, co zwiększa pewność prognostyczną.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia dostosowany do ryzyka rozwój immunoterapii poprzez wczesne potwierdzenie potencji mechanistycznej na etapie rozwoju.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w izolacji i lizie pierwotnych komórek odpornościowych w kontrolowanych warunkach, aby zachować aktywność proteaz.
- Metoda zależy od dostępu do czytnika mikropłytek zdolnego do kinetycznych pomiarów OD405 oraz kompatybilnego oprogramowania analitycznego.
- Niezbędne jest uwzględnienie kontroli z knockoutem Granzyme B w celu potwierdzenia specyficzności testu, zgodnie z przykładem w źródle.
- Adaptacja metody do innych proteaz wymaga walidacji alternatywnych substratów w celu zachowania równoważnej specyficzności i zakresu sygnału.
- Ograniczenie praktyczne: test mierzy całkowitą aktywność lizatu i może wymagać frakcjonowania w przypadku badań lokalizacji subkomórkowej.
