Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

Ogólnym celem tego zabiegu jest stworzenie reprezentatywnych kompozycyjnie, wielogatunkowych biofilmów płytki nazębnej. Równolegle do analizy osiąga się to poprzez stworzenie najpierw reprezentatywnej pożywki i inokulum. Po całonocnej inkubacji inokulum jest następnie wprowadzane do chipa mikroprzepływowego, wewnątrz mikrokanału tworzy się biofilm.

Na koniec biofilm jest myty i barwiony do dwóch konfokalnych laserowych mikroskopii skaningowych in situ lub mikroskopii fluorescencyjnej epi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak komórki przepływowe, jest to, że jest to system o wysokiej przepustowości, który pozwala na równoległe przeprowadzanie wielu eksperymentów przy użyciu mniejszej ilości materiałów i nie wymaga sztucznych pożywek laboratoryjnych. Aby rozpocząć, zbierz próbki śliny od kohorty pięciu lub więcej ochotników w pojedynczych 50-mililitrowych plastikowych probówkach.

Pobrać próbki śliny do jednej plastikowej zlewki umieszczonej na lodzie. Unikaj używania szklanych zlewek w tej konfiguracji, ponieważ biopolimery śliny mają tendencję do przylegania do szklanych powierzchni. Następnie dodaj trzy otwory do próbki, aż jego końcowe stężenie wyniesie 2,5 milimola.

Mieszaj mieszaninę przez 10 minut na lodzie. Wciągnij całą zawartość do kilku plastikowych rurek. Wirować z dużą prędkością przez 30 minut w wirówce chłodzonej o temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby oddzielić cząstki stałe od próbki.

Przenieść ślinę do świeżego, sterylnego pojemnika i wyrzucić frakcję osadów, aby przygotować z próbki pożywkę wolną od bakterii. Najpierw rozcieńczyć jednodniową próbkę wolną od zanieczyszczeń trzema objętościami wody dejonizowanej. Następnie za pomocą 0,22 mikrofiltra membranowego o niskim poziomie wiązania białka.

Wysterylizuj ślinę, utrzymując frakcję po przefiltrowaniu schłodzoną na lodzie. Elokwentnie wysterylizowany roztwór i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu, gdy będzie potrzebny. Zbierz próbki śliny od kohorty pięciu lub więcej ochotników w sterylnych 50-mililitrowych plastikowych probówkach.

Przeciągnij próbki śliny do wstępnie wysterylizowanej plastikowej zlewki o temperaturze pokojowej lub 50-mililitrowej probówki. Dodaj wysterylizowany glicerol do uzyskania 25% glicerolu. Osiąga się 75% mieszaniny śliny.

W przeciwieństwie do protokołu pożywki wzrostowej, w którym zanieczyszczenia były usuwane na etapie filtracji, sterylna technika jest tutaj ważna, aby zapobiec zanieczyszczeniu bakteriami lub grzybami, które nie są specyficzne dla jamy ustnej. Wymieszać roztwór glicerolu w ślinie. Dobrze podsycić mieszaninę śliny i glicerolu i przechowywać próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne do rozpoczęcia.

Kup lub wyprodukuj chip mikroprzepływowy z mikrokanalikiem podobnym do tych pokazanych tutaj przed zaszczepieniem próbek do mikroczipa zarówno dla pożywki o ujemnym wzroście bakterii, jak i inokulum bakterii dodatnich na stole w temperaturze pokojowej. Wiruj każdą probówkę przez pięć sekund, aby wymieszać przed przystąpieniem do głównego eksperymentu, zacznij od dodania 100 mikrolitrów pożywki wzrostowej w zbiorniku wylotowym mikroczipów. Za pomocą komputerowej pompy sterującej rozpocznij przepływ medium przez mikrokanał przez dwie minuty.

W temperaturze pokojowej sprawdź wzrokowo każdy kanał, aby zapewnić prawidłowe napełnienie płynem. Inkubować mikroczip w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Spowoduje to pokrycie ścian bocznych mikrokanalików rusztowaniem biopolimerowym, do którego biofilm zakotwiczy się podczas wzrostu.

Następnie ręcznie zassać lub pozostałe media ze zbiornika wylotowego i przenieść tę frakcję, która będzie teraz działać jako hydrodynamiczne obciążenie równoważące do zbiornika wlotowego. Po osadzeniu rusztowania biopolimerowego dodać 100 mikrolitrów inokulum bakteriododatniego do zbiornika wylotowego. Umieść mikroczip na płycie grzejnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i rozpocznij przepływ wsteczny średniego ścinania.

Podróż od wylotu do zbiornika wlotowego przez dokładnie sześć sekund. Następnie wyłącz pompę i inkubuj chip w warunkach statycznych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut, aby ułatwić przyczepienie się bakterii lub grzybów do bocznych ścianek mikrokanałów. Następnie wyjmij i wyrzuć całe inokulum ze zbiornika wylotowego za pomocą pipety i ponownie napełnij ten sam zbiornik, dodając jeden mililitr pożywki wzrostowej wolnej od bakterii.

Inkubuj mikroczip w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 20 godzin przy niskim przepływie, aby pobudzić wzrost biofilmu wewnątrzkanałowego po nocnym wzroście. Odpipetować wszystkie roztwory zarówno ze zbiornika wlotowego, jak i wylotowego. Nałóż 100 mikrolitrów PBS na zbiornik wlotowy i myj mikrokanał przez 20 minut.

Przy niskim przepływie do przodu od wlotu do wylotu, biofilm jest teraz gotowy do barwienia żywymi martwymi. Tuż przed barwieniem biofilmu należy przygotować 100 mikrolitrów mieszanki barwiącej żywotność, zgodnie z protokołem tekstowym dla każdego kanału, który ma być zabarwiony. Chronić ten roztwór przed ekspozycją na światło, dopóki nie będzie to konieczne do zabarwienia biofilmu, odessania całej pozostałej cieczy z wlotu i ponownego napełnienia tego samego zbiornika 100 mikrolitrami mieszanki barwiącej żywotność.

Następnie przepychaj roztwór barwiący przez mikrokanalik przez 45 minut. Przy niskim przepływie lemiesza w temperaturze pokojowej należy chronić chip przed działaniem światła. Odessać całą pozostałą ciecz ze zbiornika wlotowego i ponownie napełnić 100 mikrolitrami PBS.

Myj mikrokanaliki przez 20 minut przy niskim przepływie lemiesza w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar niezwiązanych barwników. Barwiony biofilm jest teraz gotowy do mikroskopii fluorescencyjnej w celu zbadania trójwymiarowej architektury biofilmów. Rekonstrukcje cyfrowe za pomocą skanów poziomych za pomocą mikroskopu konfokalnego mogą być wykorzystywane do oglądania całej struktury filmu pod dowolnym kątem.

Co więcej, analizę barwienia żywymi trupami można zastosować do tego samego zestawu danych w celu zbadania przestrzennej zależności żywotności komórek wewnątrz biofilmu w funkcji różnych zabiegów chemicznych. Po zobrazowaniu biofilmu można pobrać komórki z niewybarwionych kanałów. Używając wody destylowanej działającej przy wysokim przepływie ścinającym, flora biofilmu może być następnie zidentyfikowana na podstawie genomowego DNA za pomocą sekwencjonowania pirologicznego 4 5 4

Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak dodawanie różnych gatunków lub związków, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na różne pytania, takie jak to, co dzieje się z wielogatunkowymi biofilmami w różnych warunkach.