Wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją do zbadania ekspresji genów specyficznych dla typu komórki w tkance mózgowej szczura

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie poszczególnych typów komórek nerwowych z tkanki mózgowej w celu późniejszej analizy. Osiąga się to poprzez najpierw dysocjację tkanki nerwowej w zawiesinę pojedynczej komórki. W drugim etapie mielina jest usuwana z zawiesiny, a następnie komórki są barwione pod kątem przeciwciał specyficznych dla typu komórki.

W ostatnim etapie poszczególne populacje komórek są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej. Ostatecznie ta metoda izolacji specyficznej dla typu komórki pozwoli użytkownikom na oznaczanie zmian w ekspresji genów lub białek lub modyfikacji epigenetycznych w sposób specyficzny dla typu komórki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak to, które typy komórek wyrażają określone receptory, które wyrażają określone białka i które wyrażają pewne modyfikacje epigenetyczne, abyśmy mogli lepiej zrozumieć mechanizmy specyficzne dla typu komórki w mózgu.

Rozpocznij dysocjację neuronalną za pomocą sterylnych żyletek, aby pokroić każdą próbkę pobraną z dorosłych tkanek mózgowych na małe kawałki o wielkości od 30 do 400 miligramów na pokrywie sześciodołkowej płytki hodowlanej. Następnie zanurz tkankę w jednym mililitrze HBSS bez wapnia i magnezu i za pomocą pipety przenieś próbki do sterylnych dwumililitrowych probówek wirówkowych, gdy wszystkie tkanki zostaną zebrane. Odwirować próbki i odessać supernatanty.

Dodaj 1 900 mikrolitrów ciepłego enzymu. Wymieszaj jeden z nich i inkubuj próbki przez 15 minut. W kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza należy kilkakrotnie odwrócić rurkę co pięć minut, aby ponownie zawiesić osadzone kawałki tkanki.

Pod koniec inkubacji dodać 30 mikrolitrów świeżo przygotowanego enzymu. Wymieszaj po dwie z każdą próbką i delikatnie odwróć probówki. Następnie, używając pipety oznaczonej jako jedna, oddziel każdą próbkę za pomocą 30 iteracji w górę iw dół.

Uważaj, aby nie generować bąbelków. Inkubować próbki przez kolejne 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z odwróceniem co pięć minut, a następnie dysocjacją próbek za pomocą pipety szkodnika. Po drugie, jak właśnie zademonstrowano.

Następnie przełącz się na pipetę numer trzy, powtórz dysocjację i inkubuj próbki jeszcze przez 10 minut. W łaźni wodnej z inwersją co pięć minut pod koniec inkubacji przefiltrować zawiesiny pojedynczych komórek przez sitka komórkowe o średnicy 80 mikronów do 15-mililitrowych probówek Falcona. Mycie każdego sitka 10 mililitrami HBSS bez wapnia i magnezu w celu zatrzymania reakcji enzymatycznych po przefiltrowaniu ostatniej próbki, odwirować probówki i zassać supernatanty w celu zubożenia mieliny z komórki.

Zawiesiny dokładnie ponownie zasmają granulki w 400 mikrolitrach buforu do usuwania mieliny i dodaj odpowiednią ilość kulek do usuwania mieliny do każdej probówki. Pipetować roztwory w górę i w dół, aż komórki i kulki dokładnie się wymieszają. Następnie inkubować próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.

Po inkubacji umyj każdą próbkę w pięciu mililitrach buforu do usuwania mieliny, podczas gdy komórki się obracają, umieść jedną kolumnę dla każdej próbki w polu magnetycznym sortownika magnetycznego i umieść czysty filtr o średnicy 80 mikronów na górze każdej kolumny. Przepłukać każdy filtr i kolumnę jednym mililitrem buforu do usuwania mieliny trzy razy, zbierając cały przepływ w pojemniku na odpady. Po ostatnim płukaniu umieść pięć mililitrowych rurek z okrągłym dnem polistyrenu bezpośrednio pod każdą kolumną, aby zebrać eluat.

Następnie odessać super nazwany z próbek i ponownie zawiesić granulki w 500 mikrolitrach buforu do usuwania mieliny. Natychmiast nałóż zawiesiny komórek na kolumny, zbierając komórki w probówkach poniżej. Następnie przepłucz każdy filtr i kolumnę cztery razy jednym mililitrem usuwania mieliny, buforem na pranie.

Po ostatnim płukaniu odwirować komórki i odessać supernatanty w celu wybarwienia komórek do sortowania za pomocą cytometrii przepływowej. Wiruj każdą próbkę przez około dwie sekundy, aby oddzielić granulki i przenieś jeden mikrolitr komórek z każdej probówki do pojedynczych probówek. W celu kontroli barwienia natychmiast dodaj pięć mikrolitrów bloku FC do każdej probówki, łącznie z kontrolami barwienia.

Następnie ponownie zawirować próbki i inkubować je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po pięciu minutach dodaj 100 mikrolitrów odpowiedniego koktajlu przeciwciał pierwotnych. Przykryj probówki, aby chronić przeciwciała przed światłem i inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut.

Pod koniec inkubacji przemyć próbki w dwóch mililitrach buforu do przemywania wodą, następnie odessać supernatanty i oznaczyć każdą próbkę 100 mikrolitrami odpowiedniego przeciwciała wtórnego. Przykryj probówki i umieść je w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 15 minut. Następnie umyj próbki w dwóch mililitrach buforu do mycia, odwiruj próbki, a następnie odessać.

Supernatants Resus, zawiesić granulki w 250 mikrolitrach sterylnego PBS i posortować komórki tutaj pokazano, że reprezentatywne populacje komórek nerwowych posortowane przepływowo z jednego męskiego hipokampa są zagrożone najpierw ze wszystkich możliwych zdarzeń w oparciu o ich właściwości rozpraszania do przodu i na boki. Następnie pojedyncze komórki lub pojedyncze komórki zostały bramkowane z dowolnych dubletów lub większych skupisk komórek w zależności od ich wielkości, aby umożliwić dokładne sortowanie poszczególnych typów komórek, a następnie pojedyncze komórki posortowano na populacje komórek CD 11, B dodatnich i CD 11 B ujemnych z dalszym sortowaniem komórek ujemnych CD 11 B na komórki dodatnie GT jeden i TH jeden. Program analityczny został następnie wykorzystany do określenia całkowitej liczby zdarzeń w każdej populacji, a także procentu populacji rodzicielskich w celu potwierdzenia czystości posortowanych komórek.

W tym konkretnym przykładzie względna ekspresja genów specyficznych dla alternatywnego typu komórki została przeanalizowana za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Zgodnie z oczekiwaniami, dane te potwierdziły czystość posortowanych komórek, a także zidentyfikowały kilka interesujących różnic między badanymi regionami mózgu. Po potwierdzeniu czystości rodzaju, ekspresja innych genów będących przedmiotem zainteresowania może być mierzona w celu określenia konkretnego typu komórek, w których są one wyrażane, lub czy ich ekspresja ulega zmianie po podaniu działaniu substancji w sposób specyficzny dla typu komórki.

Na przykład tutaj badano ekspresję krowiego wiązania, białka wiążącego wapń często używanego do identyfikacji neuronów w hipokampie i móżdżku. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować określone typy komórek nerwowych, takie jak pokazana tutaj komórka nerwowa, używając odpowiednich przeciwciał na powierzchni komórki.