Obrazowanie dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy
6 maja 2015
Opisujemy protokół monitorowania dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopków za pomocą preparatu ex-vivo siatkówki myszy. Protokół ten umożliwia kompleksowe badania sygnalizacji stożka Ca2 + w ważnym systemie modelowym ssaków, myszy.
Ogólnym celem tej procedury jest rejestrowanie sygnałów wapniowych wywołanych bodźcem świetlnym z fotoreceptorów czopków w siatkówce myszy za pomocą biosensora fluorescencyjnego. Osiąga się to poprzez wyizolowanie siatkówki od transgenicznej linii myszy, która wyraża genetycznie kodowany czujnik wapnia wyłącznie w fotoreceptorach czopków. Drugim krokiem jest wycięcie pionowych wycinków tkanki siatkówki.
Następnie plastry siatkówki są umieszczane na szkiełkach nakrywkowych i umieszczane pod mikroskopem dwufotonowym. Ostatnim krokiem jest rejestrowanie sygnałów wapniowych z poszczególnych zakończeń synaptycznych fotoreceptorów czopków w odpowiedzi na stymulację światłem. Ostatecznie zarejestrowane sygnały wapniowe są analizowane w trybie offline.
Dzięki tej metodzie możemy rejestrować aktywność wielu receptorów pokarmowych kukurydzy jednocześnie w rozdzielczości subkomórkowej. Jest to główna przewaga nad istniejącymi technikami, takimi jak elektryczne, jednokomórkowe nagrania, które są trudniejsze i bardziej czasochłonne. Pytanie, na które chcielibyśmy odpowiedzieć, brzmi: czy i w jaki sposób wapń bierze udział w degeneracji fotoreceptorów.
Metoda ta pozwala nam określić, czy napływ wapnia napędza degenerację fotoreceptorów, czy też jest to wynik faktu, że komórka umiera. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności głównie dlatego, że siatkówka wrażliwa na światło co tydzień musi być zachowana, a zatem wszystkie delikatne kroki, w tym siatkówka, rozwarstwienie i plasterek jonowy, muszą być przeprowadzane w zielonym czerwonym świetle. Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś gałkę oczną myszy na szalkę Petriego zawierającą świeżo natleniony roztwór zewnątrzkomórkowy z węglowodanami.
Przekłuć gałkę oczną w dowolnym miejscu wzdłuż granicy między rogówką a twardówką ostrą igłą do wstrzykiwań. Następnie przytrzymaj oko przy twardówce za pomocą kleszczy i delikatnie włóż jedno ostrze nożyczek do otworu. Przetnij wzdłuż aury serrata, aby oddzielić przednią część oka od muszli ocznej.
Następnie przeciąć muszlę oczną promieniście w miejscu śladu pióra, aby wskazać pozycję grzbietową na siatkówce. Następnie ustaw muszlę oczną tak, aby odcięcie grzbietowe było skierowane do tyłu. Chwyć twardówkę po lewej i prawej stronie muszli ocznej, wkładając końcówki kleszczy między siatkówkę a twardówkę.
Następnie odłącz siatkówkę, delikatnie odwracając twardówkową część iica. Na koniec przetnij nerw wzrokowy, aby uwolnić siatkówkę od twardówki. Przytrzymaj krawędź siatkówki za pomocą kleszczy i delikatnie usuń zanieczyszczenia i ciało szkliste z powierzchni siatkówki za pomocą drugiej pary kleszczyków.
Gdy powierzchnia siatkówki jest czysta, wykonaj trzy dodatkowe krótsze promieniowe cięcia. Teraz powoli zanurz szklane szkiełko w roztworze zewnątrzkomórkowym w pobliżu tkanki. Delikatnie pociągnij siatkówkę na szkiełko szklaną stroną z komórką zwojową do góry, chwytając za krawędź, aby zmniejszyć uszkodzenia mechaniczne i fałdowanie tkanki.
Następnie wytnij prostokąt o wymiarach około jednego na dwa milimetry z wybranego obszaru siatkówki za pomocą zakrzywionego ostrza skalpela, zetrzyj nadmiar roztworu wokół tkanki. Następnie umieść wstępnie przygotowaną membranę z włókna nitrocelulozowego na wierzchu kawałka siatkówki, tak aby strona komórki zwojowej przylegała do membrany. Natychmiast dodaj kroplę podłoża zewnątrzkomórkowego na błonę, aby mocno przymocować do niej tkankę.
Przenieś tkankę siatkówki zamontowaną na błonie do komory krojenia zawierającej świeży roztwór zewnątrzkomórkowy. Następnie pokrój siatkówkę na pionowe plastry o grubości 200 mikrometrów. Za pomocą kleju do rozdrabniania bibułek, pojedynczy plasterek przymocowany do membrany na szklanym szkiełku nakrywkowym wstępnie przygotowanym ze smarem o wysokiej próżni.
Utrzymuj szklaną powierzchnię poniżej siatkówki i wolną od tłuszczu. Następnie dodaj kroplę roztworu zewnątrzkomórkowego do każdego plastra zamontowanego na szkiełku nakrywkowym w komorze przechowywania w temperaturze pokojowej. Wprowadzić karbogen do komory, bulgocząc w małym zbiorniku wodnym i utrzymując atmosferę w komorze przetrzymywania. Nawilżony.
Pozostaw plastry w komorze do przechowywania na 10 do 15 minut przed przeniesieniem ich pojedynczo do komory rejestracyjnej. Przenieś plasterek z komory przetrzymywania do komory rejestracyjnej i natychmiast rozpocznij perfuzję gazowanego roztworu zewnątrzkomórkowego. Utrzymuj natężenie przepływu perfuzyjnego wynoszące dwa mililitry na minutę i temperaturę 37 stopni Celsjusza.
W komorze nagraniowej. Użyj obiektywu do zanurzenia w wodzie 20 x 0.95 NA i kamery CCD w połączeniu z diodą LED na podczerwień pod komorą nagrywania. Aby zlokalizować wycinek siatkówki, uruchom system obrazowania dwufotonowego zgodnie ze wskazówkami producenta.
Następnie włącz laser i ustaw go na 860 nanometrów. Włącz dwa kanały detekcji do obrazowania fluorescencyjnego ECFP i cytrynu. Następnie, korzystając z oprogramowania do akwizycji obrazu, kontroluj dwa mikroskopy fotonowe, aby zeskanować i wybierz rząd końcówek stożkowych do nagrywania, ustaw akwizycję obrazu na obrazy o wymiarach 128 na 16 pikseli lub podobną konfigurację, ogranicz skanowany obszar do końcówek stożkowych, aby uniknąć blaknięcia pigmentów fotograficznych w zewnętrznych segmentach.
Włącz laser. Pozwól stożkom dostosować się do lasera skanującego i światła tła bodźca przez 20 do 30 sekund przed zaprezentowaniem bodźców świetlnych lub zastosowaniem środków farmakologicznych. Teraz rozpocznij prezentację dowolnych bodźców.
Bodźce są generowane poprzez modulację intensywności dwóch diod LED w czasie, za pomocą płytki mikroprocesorowej sterowanej przez niestandardowe oprogramowanie. Następnie rozpocznij nagrywanie dwóch kanałów fluorescencyjnych jednocześnie za pomocą odpowiedniego oprogramowania do akwizycji obrazu. Nagrania koncentrowały się na zakończeniach synaptycznych fotoreceptorów czopków w wycinkach siatkówki.
Jest to przykład zarejestrowanego regionu z siedmioma pojedynczymi terminalami. Fluorescencję zarejestrowano przy użyciu dwóch kanałów, jednego dla cytrynu z berła frek, a drugiego dla donora fretu. ECFP. Pokazano. Oto zmiany wywołania światła we fluorescencji cytrynu i ECFP zarejestrowane w pojedynczym obszarze zainteresowania.
A oto reakcje wapniowe końcówki stożka na serię jednosekundowych błysków jasnego światła w odstępach pięciosekundowych. Rysunek ten przedstawia przykładową analizę ilościową odpowiedzi stożków wapniowych wywołanych światłem. A oto wywołane światłem reakcje wapnia z pojedynczego stożka.
Rysunek ten przedstawia określenie średniej odpowiedzi na wapń. Spoczynkowy poziom wapnia reprezentuje linię bazową przed stymulacją światłem, a wielkość odpowiedzi wynosi ra, czyli obszar między spoczynkowym poziomem wapnia a amplitudą piku oraz między kinetyką początku i przesunięcia odpowiedzi. Procedura ta może być jeszcze bardziej rozszerzona.
Na przykład sygnały wapniowe fotoreceptorów mogą być ważne w różnych warunkach farmakologicznych i dużej stymulacji, aby zbadać adaptację lub szczegółowo zbadać różne etapy transdukcji foto. Technika ta pozwala na badanie dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopków w normalnych warunkach fizjologicznych. Jest to szczególnie istotne dla zrozumienia pierwotnego i wtórnego zwyrodnienia fotoreceptorów czopków w chorobach powodujących ślepotę u ludzi, takich jak acrotopia lub barwnikowe zwyrodnienie siatkówki.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokół monitorowania dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopkowych z wykorzystaniem preparatów ex-vivo wycinków siatkówki mysiej. Metoda ta umożliwia kompleksowe badania sygnalizacji Ca2+ w czopkach w ssaczym modelu badawczym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Funkcje fotoreceptorów
Wstęp
- Sygnalizacja wapniowa jest kluczowa dla funkcjonowania fotoreceptorów.
- Zrozumienie dynamiki Ca2+ może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów degeneracji fotoreceptorów.
- Istniejące techniki badania tej dynamiki są często złożone i czasochłonne.
- Celem niniejszego protokołu jest uproszczenie tego procesu przy jednoczesnym zapewnieniu danych o wysokiej rozdzielczości.
Cel badania
- W celu rejestracji wywołanych światłem sygnałów wapniowych w fotoreceptorach czopkowych.
- W celu zbadania roli wapnia w degeneracji fotoreceptorów.
- W celu umożliwienia jednoczesnej rejestracji sygnałów z wielu zakończeń czopków z rozdzielczością subkomórkową.
Zastosowane metody
- Izolacja siatkówki z myszy transgenicznej wykazującej ekspresję genetycznie kodowanego sensora wapnia.
- Przygotowanie pionowych przekrojów tkanki siatkówki.
- Mikroskopia dwufotonowa do obrazowania sygnałów wapniowych.
- Analiza odpowiedzi wapniowych na bodźce świetlne.
Główne wyniki
- Pomyślna rejestracja dynamiki wapnia w fotoreceptorach czopkowych.
- Wykazanie możliwości analizy odpowiedzi wapniowej na różne bodźce świetlne.
- Przedstawienie spostrzeżeń na temat związku między napływem wapnia a kondycją fotoreceptorów.
- Wskazanie zalet tej metody w porównaniu z technikami tradycyjnymi.
Wnioski
- Niniejszy protokół oferuje niezawodną metodę badania dynamiki Ca2+ w fotoreceptorach czopkowych.
- Umożliwia on badanie roli wapnia w degeneracji fotoreceptorów.
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie mechanizmów sygnalizacji siatkówkowej.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Ilościowe obrazowanie dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopkowych pozwala wypełnić istotną lukę w zrozumieniu mechanizmów degradacji siatkówki. Niniejszy protokół umożliwia wysokorozdzielczy, multipleksowy pomiar odpowiedzi Ca2+ wywołanych bodźcem, co zwiększa pewność predykcyjną w procesie walidacji celów w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Podejście to ma na celu wsparcie wczesnego etapu odkryć oraz strategii translacyjnych w ramach projektów przywracania wzroku.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celu
- Umożliwia badanie zależnych od Ca2+ szlaków sygnałowych zaangażowanych w degenerację fotoreceptorów.
- Wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez odróżnianie przyczynowego od wtórnego napływu Ca2+ w modelach chorób.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów w genetycznie modyfikowanych liniach myszy istotnych dla ludzkich schorzeń siatkówki.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany system ex vivo do ilościowych i powtarzalnych odczytów Ca2+ w terminalach czopków.
- Umożliwia standaryzację i skalowalność testów w celu przesiewowego badania związków lub modyfikatorów genetycznych.
- Dostarcza danych o rozdzielczości subkomórkowej, co pozwala na wiarygodną ocenę potencjalnych interwencji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami istotnymi dla badanych chorób w zakresie analizy mechanizmów pierwotnej i wtórnej degeneracji czopków.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkryć po walidację przedkliniczną, umożliwiając krzyżowanie z modelami degeneracyjnymi.
- Oferuje wartość prognostyczną dla rozwoju translacyjnych biomarkerów w procesach badawczych nad chorobami siatkówki.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół obrazowania integruje się z kontinuum od odkryć do badań przedklinicznych, łącząc studia mechanistyczne z badaniami translacyjnymi w zakresie chorób siatkówki.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie zmian stężenia Ca2+ wywołanych bodźcem w celu wyjaśnienia szlaków sygnałowych fotoreceptorów oraz czynników wyzwalających ich degenerację.
- Przesiewanie: Ustalanie powtarzalnych, ilościowych punktów końcowych do oceny interwencji farmakologicznych lub genetycznych.
- Analityka: Dostarczanie pomiarów bezwzględnych i względnych stężeń Ca2+ dla rzetelnego porównania statystycznego między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Umożliwienie dopasowania do modeli chorobowych oraz wsparcie rozwoju strategii biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Możliwość adaptacji do różnych modeli mysich i warunków eksperymentalnych w celu szerokiego zastosowania w badaniach i rozwoju (R&D).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz zrozumienie mechanizmów degeneracji siatkówki.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne schematy obrazowania dla porównywalności międzybadawczej.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach programów przywracania wzroku.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów i interwencji w potokach badawczych nad neurodegeneracją w oparciu o analizę ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w preparatyce siatkówki, mikroskopii dwufotonowej oraz pracy z genetycznie kodowanymi biosensorami.
- Wymaga specjalistycznego sprzętu obrazowego oraz infrastruktury do analizy fluorescencji.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Metoda jest możliwa do zastosowania w różnych modelach mysich, lecz wrażliwa na sposób obchodzenia się z tkanką oraz warunki ekspozycji na światło.
- Zależna od dostępności linii transgenicznych oraz protokołów kalibracji dla bezwzględnego oznaczania ilości Ca2+.
