Barwienie owadów do testów behawioralnych: zachowanie godowe znieczulonych Drosophila
22 kwietnia 2015
Ten protokół opisuje prosty, ekonomiczny sposób indywidualnej identyfikacji Drosophila lub innych owadów. Dane demonstracyjne badające sukces godowy trzech gatunków Drosophila pokazują, że metoda ta jest porównywalna lub lepsza niż zastosowanie znieczulenia CO2 .
Ogólnym celem tej procedury jest sprawienie, aby owady widocznie różniły się od siebie w sposób nieinwazyjny w celu ich identyfikacji w eksperymentach behawioralnych. Osiąga się to poprzez najpierw widoczne zabarwienie powierzchni normalnego pokarmu dla muszek w standardowej fiolce na muchy kilkoma kroplami barwnika spożywczego. Następnie muchy dodaje się do fiolki na trzy godziny, po czym muszki powinny wykazywać silne zabarwienie brzucha.
Eksperymenty godowe można przeprowadzić, na przykład, aby zaobserwować, czy samice uważają samce farbowane na określony kolor za bardziej atrakcyjne. Ostatecznie ta technika barwienia jest szybkim, prostym i nieinwazyjnym sposobem oznaczania owadów w celu łatwej identyfikacji eksperymentalnej. Główną zaletą stosowania tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak usunięcie części skrzydła muchy, jest to, że jest ona szybsza, mniej inwazyjna i mniej podatna na późniejsze zachowanie.
Ta metoda może być przydatna w wielu różnych eksperymentach, w których ważna jest identyfikacja osobników lub klas much. Jest również dość łatwy do wykorzystania w prostych eksperymentach w szkołach lub na uczelniach. Zademonstrują tę technikę Rudy Verse Bo i Chloe Hayes, oboje doktoranci na Uniwersytecie w Liverpoolu Po wywołaniu i zestaleniu żywności zacznij od dodania 0,5 do jednego mililitra niebieskiego barwnika spożywczego na wierzchu żywności, rozprowadź barwnik na całej powierzchni fiolki.
Następnie przechowuj żywność w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa dni, aby dieta mogła zostać wchłonięta przez wierzchnią warstwę żywności. Następnie przenieś muchy na pokarm zgodnie z potrzebami eksperymentu. W ciągu jednego dnia muchy dietetyczne można łatwo odróżnić od much niefarbowanych, aby przeprowadzić próbę godową z farbowanymi muchami.
Użyj aspiratora, aby przenieść poszczególne dziewicze samce do standardowych plastikowych fiolek o wymiarach 75 na 20 milimetrów zawierających 20 mililitrów żywności. W przypadku wykonywania próby krycia z dwoma samcami, umieść połowę samców w każdej grupie leczonej w fiolkach z kolorowym pokarmem. Następnie przenieś nowo powstałe samice do fiolek ze świeżą żywnością w grupach po 10 sztuk.
Teraz pozwól obu płciom dojrzeć do wieku godowego w odpowiedniej dla gatunku temperaturze. Kiedy drosophila będzie gotowa, wystaw eksperymentalne samce na pożądane leczenie. Na przykład, inne muszki są znieczulane dwutlenkiem węgla i oznaczają fiolki, aby zidentyfikować zarówno leczenie, jak i status koloru much w dniu poprzedzającym badanie.
Przenieś samice do pojedynczych fiolek zawierających 20 mililitrów pokarmu, aby zaaklimatyzować muchy do fiolki godowej i oznacz fiolki neutralnymi etykietami, aby zaślepić eksperyment. Następnie dodaj jednego lub dwa samce much do każdej fiolki godowej zawierającej pojedynczą samicę muchy. W stosownych przypadkach.
Rozpocznij próbę krycia tak, aby zbiegła się w czasie z zapaleniem się świateł w inkubatorze dla dwóch prób krycia samców. Zadbaj o to, aby każdy samiec pochodził z innego leczenia i aby jedna mucha wykazywała przebarwienia na brzuchu. Zapisz leczenie i ubarwienie każdego samca muchy.
Jeśli kopulacja nastąpi w ciągu dwóch godzin, zapisz status kostki samca, który łączy się w pary w próbach godowych z pojedynczym samcem. Zapisz czas rozpoczęcia i zakończenia krycia. Następnie oblicz dane dotyczące opóźnienia i czasu trwania zakończenia krycia dla próby.
Najlepszy znaleziony model wyjaśniający zmienność wpływu dwutlenku węgla. Znieczulenie zawiera gatunki jako czynnik. Na przykład w tych reprezentatywnych eksperymentach znieczulenie dwutlenkiem węgla nie wykazało znaczącego wpływu na sukces godowy drosophila.
Muchy pseudo obscure i drosophila sub obscure w dwóch próbach samców dla Drosophila melanogaster, jednak znacznie niższy sukces godowy zaobserwowano u samców wystawionych na znieczulenie dwutlenkiem węgla z jeszcze większym efektem, gdy Drosophila melanogaster były wystawione na działanie gazu podczas pobierania lub dzień przed próbami. Nie zaobserwowano istotnych różnic w kojarzeniu much barwionych w kolorze spożywczym dla żadnego z trzech gatunków, ani nie zaobserwowano uwzględnienia leczenia w analizie lub statusu krycia owadów w pojedynczych próbach krycia. Nie ma różnicy w kryciu.
Opóźnienie zaobserwowano dla każdego z trzech gatunków, gdy znieczulenie dwutlenkiem węgla zostało użyte do zebrania niedawno wyłonionych dorosłych. Wpływ na czas krycia wykazywały tylko muchy Drosophila sub obscure, gdy zostały wystawione na działanie dwutlenku węgla dwa dni przed próbami godowymi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o tym, jak używać barwienia jelit jako nieinwazyjnej techniki oznaczania much podczas eksperymentów.
Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby przetestować wpływ barwnika, który Cię interesuje, na gatunki ogniskowe. Niektóre barwniki mogą być toksyczne, a niektóre kolory mogą bezpośrednio wpływać na sukces krycia. Na przykład czerwony barwnik spożywczy może być preferowany u niektórych gatunków.
Tutaj użyliśmy tej techniki barwienia do rozróżnienia much w konkurencyjnych próbach godowych. Jednak może być również stosowany w wielu innych eksperymentach, w których muchy muszą być indywidualnie identyfikowane, takich jak testy oceniające agresję, obronę terytorialną, aktywność preferencji żywieniowych lub zachowania społeczne.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje nieinwazyjną metodę identyfikacji poszczególnych osobników Drosophila oraz innych owadów przy użyciu barwników spożywczych. Technika ta umożliwia łatwą identyfikację podczas eksperymentów behawioralnych, wykazując wyniki porównywalne lub lepsze w stosunku do tradycyjnych metod, takich jak znieczulenie CO2.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia behawioralna
- Entomologia
Wstęp
- Identyfikacja poszczególnych owadów jest kluczowa dla badań behawioralnych.
- Tradycyjne metody mogą być inwazyjne i wpływać na zachowanie.
- Barwniki spożywcze stanowią szybką i prostą alternatywę.
- Metoda ta jest odpowiednia dla różnych warunków eksperymentalnych, w tym dla placówek edukacyjnych.
Cel badania
- Opracowanie nieinwazyjnej techniki identyfikacji owadów.
- Ocena atrakcyjności samic wobec samców o różnym ubarwieniu.
- Porównanie skuteczności tej metody z anestezją CO2.
Zastosowane metody
- Barwienie pożywki dla Drosophila barwnikiem spożywczym.
- Pozostawienie much do żerowania na zabarwionej pożywce przez trzy godziny.
- Przeprowadzenie prób kojarzenia z muchami zabarwionymi i niezabarwionymi.
- Rejestracja sukcesu kojarzenia i zachowania w kontrolowanych warunkach.
Główne wyniki
- Brak istotnych różnic w sukcesie kopulacyjnym między muchami barwionymi a niebarwionymi.
- Anestezja CO2 negatywnie wpłynęła na sukces kopulacyjny u niektórych gatunków.
- Technika barwienia okazała się skuteczna w identyfikacji osobniczej.
- Wpływ koloru barwnika na zachowanie powinien zostać przetestowany dla konkretnych gatunków.
Wnioski
- Metoda z użyciem barwnika spożywczego stanowi wartościową alternatywę w identyfikacji owadów.
- Technika ta jest mniej inwazyjna i szybsza niż metody tradycyjne.
- Można ją zastosować w różnych kontekstach eksperymentalnych, poza próbami kopulacyjnymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Nieinwazyjne metody znakowania są kluczowe dla zachowania integralności testów behawioralnych w procesach wczesnej walidacji celów oraz przesiewowych badań fenotypowych. Ta technika z użyciem barwników spożywczych ogranicza wpływ zmiennych zakłócających wynikających z procedur inwazyjnych, wspierając tym samym bardziej wiarygodne przesiewanie związków oraz ograniczanie ryzyka w badaniach nad mechanizmami odkryć neurobehawioralnych. Podejście to umożliwia skalowalną i powtarzalną identyfikację poszczególnych osobników u różnych gatunków, co odpowiada potrzebom przedsiębiorstw w zakresie standaryzowanych modeli przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez w testach zachowań kopulacyjnych bez wprowadzania artefaktów behawioralnych wynikających z inwazyjnego znakowania.
- Wartość operacyjna: Zapewnia szybką i niskokosztową identyfikację osobników, kompatybilną z projektami przesiewowymi o wysokiej przepustowości.
- Wartość prognostyczna: Wspiera walidację celu poprzez izolowanie efektów genetycznych lub farmakologicznych w obrębie zachowania dzięki zminimalizowaniu szumów proceduralnych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje mierzalne wyniki behawioralne (sukces kopulacji, czas latencji, czas trwania) przy zmniejszonej zmienności technicznej.
- Wartość operacyjna: Ułatwia standaryzację testu między laboratoriami dzięki prostemu, łatwo przenoszalnemu barwieniu za pomocą pożywki.
- Skalowalność: Kompatybilność z formatami wielodobowymi i zautomatyzowanymi systemami śledzenia w celu przesiewania bibliotek związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wspiera porównania behawioralne między gatunkami (D. melanogaster, D. pseudoobscura, D. subobscura) w badaniach nad konserwacją celów molekularnych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pozwala na ocenę wpływu genów lub związków na zachowanie bez zakłóceń wywołanych przez znieczulenie.
- Pewność prognostyczna: Umożliwia podłużne śledzenie behawioralne w modelach istotnych dla chorób, w których wymagane jest wielokrotne pobieranie próbek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesami biologii odkrywczej jako etap wstępnego przetwarzania w fenotypowaniu behawioralnym, poprzedzając ekspozycję na związki oraz gromadzenie wyników w kaskadach identyfikacji wiodących struktur.
- Biologia odkrywcza: Wspiera izolację zmiennych niezależnych (np. genotypu, zastosowanego leczenia) poprzez zapewnienie spójnego śledzenia poszczególnych osobników w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Przesiewy: Umożliwia odtwarzalne pomiary bazowe, niezbędne do wykrywania subtelnych zmian behawioralnych w badaniach przesiewowych związków.
- Analityka: Generuje kategoryczne i czasowe dane behawioralne (status kopulacji, latencja, czas trwania), odpowiednie do modelowania statystycznego i obliczania wielkości efektu.
- Badania translacyjne: Ułatwia wyznaczanie punktów końcowych behawioralnych zgodnych z biomarkerami w przedklinicznych modelach zaburzeń neuropsychiatrycznych.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwach: Stanowi niezależną od platformy funkcję etykietowania, którą można zastosować w testach behawioralnych opartych na owadach w środowiskach akademickich i przemysłowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez eliminację zakłóceń behawioralnych wynikających z tradycyjnych metod znakowania.
- Wartość operacyjna: Zwiększa powtarzalność i porównywalność między laboratoriami dzięki standaryzowanej, nieinwazyjnej identyfikacji.
- Wartość strategiczna: Poprawia pewność decyzji go/no-go we wczesnej fazie odkrywania poprzez zwiększenie stosunku sygnału do szumu w testach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka dzięki czystszym danym fenotypowym w kaskadach walidacyjnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w projektowaniu testów behawioralnych oraz badaniu tolerancji barwników u poszczególnych gatunków.
- Opiera się na standardowym wyposażeniu laboratoryjnym (fiolki, barwniki spożywcze, aspiratory), bez konieczności stosowania specjalistycznej aparatury.
- Wymaga standaryzacji protokołu między zespołami w zakresie stężenia barwnika, czasu ekspozycji oraz wyboru kolorów dla różnych systemów modelowych.
- Uwzględnia kwestie adaptacyjne dotyczące przepuszczalności kutykuli oraz wchłaniania pigmentów u różnych gatunków owadów i w różnych stadiach rozwojowych.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak potencjalna toksyczność barwnika lub specyficzne dla gatunku preferencje kolorystyczne, wymagające walidacji empirycznej.
