Technika mikroperfuzji do badania regulacji przepuszczalności mikronaczyń w krezce szczura

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest umożliwienie wielokrotnych pomiarów przewodności hydraulicznej lub przepuszczalności wody ścianek mikronaczyń Ular u szczura w kontrolowanych warunkach doświadczalnych. Osiąga się to poprzez kaniulowanie mikronaczyń hydraulicznych, aby umożliwić ustawienie ciśnienia onkotycznego i hydrostatycznego w świetle oraz umożliwić precyzyjną kontrolę składu chemicznego ósemki obfitej i ósemki. Następnie naczynie jest zamykane, a krwinki czerwone zawieszane w ósemce PERFUSE, które działają jak markery przepływu poruszające się w świetle jako wskaźniki wymiany płynu transnaczyniowego.

Następnie pozycja i prędkość czerwonych krwinek markerowych są rejestrowane w kierunku miejsca okluzji lub z dala od miejsca okluzji. Na koniec okluzja jest zwalniana i powtarzana w celu dodatkowych pomiarów lub naczynie jest nagrywane. Kaniulowane i pomiary są powtarzane w zmienionych warunkach.

Ostatecznie, można wykonać sparowane pomiary przewodności hydraulicznej w warunkach kontrolnych i testowych, aby umożliwić jak najbardziej bezpośrednie badanie czynników regulujących mikrozbiorniki. Przepuszczalność. Zaletą zmodyfikowanej techniki landis do badania regulacji przepuszczalności naczyń włosowatych jest etap perfuzji. Mikroperfuzja umożliwia pomiar przepuszczalności ścianek mikronaczyń w warunkach, w których skład PERFUSE ósemka, powierzchnia wymiany i ciśnienie mikronaczyń są bezpośrednio kontrolowane.

Metoda ta może odpowiedzieć na pytania dotyczące komórkowych i molekularnych mechanizmów regulacji przepuszczalności w mikronaczyniach, które są reprezentatywne dla nienaruszonych narządów, a także może zapewnić porównanie z wynikami z hodowanych monowarstw śródbłonka, które często są wykorzystywane do badania szczegółów mechanizmów molekularnych. Naszą procedurę demonstruje Joyce Clark, kierownik naszego laboratorium. Joyce była odpowiedzialna za wiele ulepszeń tego protokołu podczas swojej pracy jako kierownik naszego laboratorium.

Na początek użyj elektronicznego ściągacza, aby uformować kilka czystych rurek kapilarnych ze szkła krzemianowego boro w zwężające się połówki, każda z końcówką o długości około jednego centymetra, za pomocą napędzanej powietrzem ściernicy i papieru ściernego o grubości 0,5 mikrona skąpanego w wodzie oraz uchwytu na mikropipety ustawionego pod kątem 30 stopni od poziomego skosu, mikropipety. Po umyciu i wysuszeniu mikropipet zgodnie z protokołem tekstowym, należy wybrać mikropipety z otworem o długości około 50 mikronów i stosunkiem długości do szerokości skosu od 3,1 do 3,5. Powinny mieć również ostro zwężający się czubek, który pomaga penetrować twarde włókna kolagenowe w krezce.

Aby zrobić krępujące, krótko przytrzymaj nieskośną, ciągnioną szklaną kapilę w pobliżu mikropłomienia, aby utworzyć koniec. Powtórz tę czynność, aby zrobić kilka ograniczników i przechowywać w pudełku bezpyłowym. Następnie wykonaj mikrookluzje, trzymając nieskośnie ciągniętą rurkę kapilarną pod kątem pod mikropłomieniem i użyj adaptera do rurki lub uszkodzonej mikropipety, aby delikatnie zgiąć rurkę około czterech milimetrów od końcówki pod kątem zbliżonym do 120 stopni.

Jeśli chodzi o wał, ważne jest, aby końcówka nie była ani uszczelniona w płomieniu, ani złamana. Po znieczuleniu szczura i ułożeniu tkanki mesentariusza i jelita zgodnie z protokołem tekstowym, umieść tacę na zwierzę na stoliku mikroskopu tak, aby mesentariusz był widoczny przez okulary. Ustaw grawitacyjną linię kroplową roztworu dzwonka ssaków, aby w sposób ciągły łączył się.

Następnie mesentariusz używa gazików, aby utrzymać jelito na miejscu, pomóc zatrzymać wilgoć i odprowadzić nadmiar dzwonków z powierzchni, dostosować przepływ i zassać ścieki, aby utrzymać stałą warstwę suse ósemki, zidentyfikować docelowe mikronaczynia flar, które są nierozgałęzionymi segmentami poniżej przepływu zbieżnego i jedną lub dwiema gałęziami dystalnymi do prawdziwych naczyń włosowatych. Znajdź nierozgałęzione naczynie o szybkim przepływie krwi i wolne od białych krwinek przyklejających się do ściany naczynia. Mieć. Umieść mikronaczynia testowe w środku pola mikroskopu i przesuń ogranicznik na miejsce w pobliżu wybranego miejsca kaniulacji.

Aby napełnić mikropipetę, należy pobrać perfuzję ósemkową i umyć erytrocyty do strzykawki przygotowanej zgodnie z protokołem tekstowym, upewnić się, że w rurki nie ma pęcherzyków. Wsuń rurkę do dużego końca mikropipety, aż będzie przylegać do stożkowego obszaru. Delikatnie i szybko nacisnąć tłok strzykawki, aby napełnić końcówkę mikropipety.

Mały strumień lub kropla pojawi się na końcówce, gdy będzie pełna. Podczas wyjmowania rurki delikatnie naciśnij tłok, aby napełnić trzon mikropipety. Następnie usuń małe pęcherzyki z trzonu, delikatnie go przesuwając.

Następnie umieść mikropipetę w uchwycie na pipety z bocznym portem, który umożliwia ciągłe podłączenie płynu do manometru wodnego. Upewnij się, że uchwyt, który jest przymocowany do napędu hydraulicznego i mikromanipulatora, jest ustawiony pod niewielkim kątem poziomym, tak aby krawędź stożka mikropipety nie uderzała w jelito lub tackę. Za pomocą strzykawki lub gumowej gruszki wypełnionej wodą wyreguluj ciśnienie hydrostatyczne wywierane na płyn w mikropipecie, zmieniając wysokość płynu w słupie wody manometru na około 40 centymetrów wody powyżej krezki.

Przed umieszczeniem napełnionej mikropipety pod mikroskopem, delikatnie dociśnij ogranicznik do tkanki w pobliżu mikronaczyń, przykładając wystarczającą siłę, aby chwycić tkankę, lekko pociągnij ogranicznik do tyłu, rozciągając tkankę w linii mikronaczyń tak, aby naprężenia we włóknach kolagenowych krezki były wyrównane z naczyniem. Dopasuj mikropipetę do naczynia i opuść ją w pole widzenia przez okulary. Umieść końcówkę tuż przed wybranym miejscem kaniulacji i opuść ją na tkankę tak, aby częściowo utrudniała przepływ w naczyniu, ale go nie zamykała.

Za pomocą napędu hydraulicznego wykańczać naczynie, powoli wbijając końcówkę pipety w światło naczynia, uważając, aby nie przepchnąć końcówki przez drugą stronę naczynia. Gdy mikropipeta wejdzie do światła, perfuse eight szybko wypłucze krew ze światła naczynia i wejdzie do krążenia. Obniż ciśnienie perfuzji, regulując manometr, aż czerwone krwinki delikatnie oscylują w świetle naczynia.

Określa to ciśnienie równoważące, które mierzy ciśnienie w mikronaczyniach hydrostatycznych lub PC na dystalnym końcu segmentu mikrozbiorników. Utrzymuj perfuzję naczynia powyżej tego ciśnienia równowagi, aby przeprowadzić mikrookluzję. Umieść bloker nad perfundowanym naczyniem w pobliżu dolnej krawędzi pola mikroskopu, korzystając z obrazu i dźwięku.

Zapisz ustnie lokalizację miejsca bloku, jak pokazano na czerwono w I części. Miejsce bloku znajduje się 57 Z końcówką blokera umieszczoną tuż nad mikro naczyniem. Użyj precyzyjnego regulatora Z mikromanipulatora, aby delikatnie opuścić bloker, aż przepływ w naczyniu zostanie zablokowany.

Użyj dźwięku, aby zanotować ciśnienie manometru. Ciśnienie wynosi 50. Następnie zastosuj okluzję na trzy do 10 sekund i zwolnij.

Aby przywrócić swobodną perfuzję, należy przesunąć miejsce bloku w górę naczynia w kierunku końcówki pipety w krokach od pięciu do 10 mikronów, wykonując nie więcej niż trzy do pięciu okluzji w każdym miejscu, aby zapobiec uszkodzeniu ścianki naczynia w miejscu blokady. Analizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym. Ten kurs czasowy mierzy zmiany przewodności hydraulicznej lub LP.In szczurzych mikronaczyń pomyślnie kaniulowanych czterema perfuzyjnymi ósemkami.

Wielkość LP przy stałym ciśnieniu wykorzystano do pomiaru zmian w mikronaczyniach. Przepuszczalność ścian po perfuzji z 1% BSA jako kontrola w porównaniu z 10 molami czynnika zapalnego Brady Kinin lub bk. Jak pokazano tutaj, BK spowodował przejściowy wzrost LP, który powrócił do poziomów kontrolnych w ciągu 10 do 15 minut.

Po przywróceniu poziomów wyjściowych z 1% nanomolem BSA 10. BK poddano reperfuzji wraz z jednym mikromolowym stworzeniem pH, jednym fosforanem lub S jednym P. Wyniki wskazują, że S jeden P znacznie osłabił odpowiedź na bk. W przypadku niektórych projektów eksperymentalnych ważne jest oszacowanie zarówno współczynnika odbicia solut dla makrocząsteczki, jak i lp.

Najlepiej osiąga się to poprzez pomiar JV przy wielu ciśnieniach na każdym pojedynczym mikrozbiorniku. W eksperymencie tym oszacowano zarówno LP, jak i efektywne ciśnienie onkotyczne 5% albuminy w ósemce PERFUSE, gdy w tkance otaczającej mikronaczynia nie było albuminy. JV nad S zmierzono przy trzech różnych ciśnieniach i wykreślono. Tu.

LP jest nachyleniem zależności między JV nad S a ciśnieniem, a punkt przecięcia na osi ciśnienia to efektywna różnica ciśnień onkotycznych na ścianie naczynia. W połączeniu z innymi technikami, takimi jak znakowanie immunofluorescencyjne i mikroskopia konfokalna, a nawet transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroprofuzja zapewnia potężną analizę śródbłonka i funkcji mikronaczyniowej przy użyciu naczyń o znanej przepuszczalności. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dokonywać powtarzających się pomiarów przewodności hydraulicznej lub przepuszczalności wody mikronaczyń ulicznych w szczurzym mesentry'm w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych.

Można zastosować to podejście w obecnie dostępnych modelach szczurzych, ale szczególnie interesuje mnie możliwość, że można je zastosować u nowych genetycznie zmodyfikowanych szczurów, które staną się dostępne z technologią CRISPR Cas 9 i mam nadzieję, że zostanie to w ten sposób rozszerzone.