Badanie społeczności drobnoustrojów in vivo: model interakcji między Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych za pośrednictwem gospodarza
13 stycznia 2016
Podczas gdy badania in vitro interakcji gospodarz-patogen pozwalają na scharakteryzowanie specyficznych odpowiedzi immunologicznych, modele in vivo są wymagane do obserwacji efektów złożonych odpowiedzi. Wykorzystując ekspozycję na Candida albicans, a następnie infekcję płuc za pośrednictwem Pseudomonas aeruginosa, ustaliliśmy mysi model interakcji mikrobiologicznych zaangażowanych w patogenność zapalenia płuc związaną z respiratorem.
Ogólnym celem tej procedury jest zbudowanie modelu do badania interakcji między pojedynczą bakterią a pojedynczym grzybem. Wiadomość ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji patogenów, takie jak czynniki zaangażowane w przesłuchy i dialekt międzygatunkowy. Główną zaletą tej techniki jest to, że dane wygenerowane z tego modelu in vivo mają znaczenie kliniczne.
Aby zainstalować grzyba donosowo, najpierw rozcieńczyć dwa razy dziesięć do szóstego CFU C.albicans na mililitr w sterylnym PBS. Następnie, po potwierdzeniu utraty odruchu prostowania u dorosłej myszy hipotonicznej, należy odessać co najmniej 50 mikrolitrów zawiesiny grzybów do pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Teraz chwyć mysz jedną ręką i obróć zwierzę tak, aby leżało na plecach z brzuchem skierowanym do pionu.
Gdy mysz znajduje się na swoim miejscu, użyj palca wskazującego ręki trzymającej mysz, aby podeprzeć głowę, a kciuka, aby utrzymać szczękę zamkniętą, i przesuń końcówkę pipety blisko nosa zwierzęcia. Następnie ostrożnie dozuj 50-mikrolitrową kroplę grzyba do nozdrzy, umożliwiając wdychanie kropli przez spontaniczny oddech myszy. I umieść mysz samą w klatce, aż w pełni wyzdrowieje.
Cztery dni po instalacji C. albicans należy ogolić brzuch zwierzęcia poddanego eutanazji, a następnie poddać odsłoniętej skórze sterylizację etanolem. Następnie użyj nożyczek, aby otworzyć skórę od mostka do połowy brzucha. Następnie przedłuż nacięcie wzdłuż klatki piersiowej po obu stronach linii środkowej i odchyl skórę po obu stronach klatki piersiowej.
Kiedy klatka piersiowa jest widoczna, wykonaj pionowe nacięcie po obu stronach klatki piersiowej w kierunku obojczyków i użyj mostka, aby odchylić całą przednią ścianę klatki piersiowej, aby uwidocznić serce i płuca. Następnie za pomocą strzykawki z heparyną należy nakłuć serce obok tętnicy śródkomorowej i pobrać minimum 500 mikrolitrów krwi. Umieść próbkę krwi na lodzie.
Następnie wykonaj nacięcie szyjki macicy w linii środkowej, aby odsłonić tchawicę. Ostrożnie rozetnij powięź wokół tchawicy, a następnie umieść szew pod tchawicą. Następnie za pomocą zmodyfikowanej igły do głębka o rozmiarze 20 należy cewnikować tchawicę, zabezpieczając kaniulę wcześniej założonym szwem.
Aby wykonać płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, delikatnie dozuj 500 mikrolitrów lodowatego PBS do płuc. Następnie odessać płyn z płukania i przenieść płyn do dwumililitrowej probówki wirówkowej na lodzie. Po pobraniu dwóch kolejnych próbek o pojemności 500 mikrolitrów usuń płuca z klatki piersiowej i umieść kawałek płuca w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej w celu natychmiastowego przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Następnie umieść kolejny kawałek tkanki płucnej w wstępnie zważonej probówce do hemolizy zawierającej PBS na lodzie. Na koniec wykonaj nacięcie po lewej stronie brzucha. Zbierz śledzionę do drugiej probówki do hemolizy zawierającej jeden mililitr PBS i umieść probówkę na lodzie.
Model trwałości czterodniowej uzyskuje się przez instalację donosową pięć razy dziesięć do piątej CFU C. albicans na mysz. W ciągu tych czterech dni myszy przybierają na wadze, ale nie wykazują uszkodzenia płuc. Jednak wraz ze wzrostem CFU inokulum dochodzi do uszkodzenia płuc.
Maksymalne uszkodzenie płuc obserwowane jest od 24 do 36 godzin po zakażeniu. Z kolei obciążenie bakteryjne wykazuje spadek o jeden log CFU na mililitr co 24 godziny, przy czym skumulowany wzrost rozprzestrzeniania się bakterii obserwuje się z każdym dniem. W popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych pobranych od zakażonych myszy neutrofile są szeroko rekrutowane, a różnicowa liczba komórek wykazuje 90 procent neutrofili i 10 procent limfocytów makrofagów naciekających populację komórek odpornościowych.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak analiza płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące charakterystyki odpowiedzi zapalnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbudować kolonizację Pseudomonas. Nie zapominaj, że praca z luminescencyjnym Candida może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie odzieży ochronnej, aby uniknąć zanieczyszczenia kropelkami, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania tej procedury.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie ustanawia model mysi w celu zbadania interakcji między Candida albicans a Pseudomonas aeruginosa w kontekście zapalenia płuc związanego z wentylacją mechaniczną. Model ma na celu wyjaśnienie złożonych odpowiedzi immunologicznych biorących udział w interakcjach tych patogenów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Immunologia
- Interakcje z patogenami
Wprowadzenie
- Badania in vitro dostarczają wiedzy na temat odpowiedzi odpornościowych.
- Modele in vivo są niezbędne do zrozumienia złożonych oddziaływań.
- Zapalenie płuc związane z wentylacją mechaniczną stanowi istotny problem kliniczny.
- Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa to pospolite patogeny występujące w takich zakażeniach.
Cel badania
- Opracowanie modelu do badania interakcji między bakterią a grzybem.
- Identyfikacja czynników zaangażowanych w komunikację międzygatunkową.
- Generowanie istotnych klinicznie danych z badań in vivo.
Zastosowane metody
- Podanie donosowe Candida albicans u myszy.
- Wykorzystanie hipotonicznego modelu mysiego do obserwacji odpowiedzi.
- Ocena odruchu prostowania jako miernika stanu zdrowia.
- Analiza interakcji mikrobiologicznych w środowisku płuc.
Główne wyniki
- Ustanowienie wiarygodnego modelu mysiego do badania interakcji patogenów.
- Identyfikacja kluczowych czynników w interakcjach między Candida a Pseudomonas.
- Wykazanie istotności klinicznej opracowanego modelu.
- Wnioski dotyczące patogenności zapalenia płuc związanego z wentylacją mechaniczną.
Wnioski
- Opracowany model jest skuteczny w badaniu złożonych interakcji mikrobiologicznych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia patogenezy zapalenia płuc związanego z wentylacją mechaniczną.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym modelu w celu analizy interwencji terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Modelowanie interakcji między Candida albicans a Pseudomonas aeruginosa w organizmie gospodarza in vivo pozwala wypełnić istotną lukę w zrozumieniu dynamiki polimikrobiologicznej istotnej dla zakażeń dróg oddechowych. Podejście to umożliwia mechanistyczną weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez uchwycenie złożoności układu odpornościowego oraz wzajemnego oddziaływania patogenów, co nie jest możliwe do osiągnięcia in vitro. Model ten zwiększa wiarygodność predykcyjną badań translacyjnych ukierunkowanych na chroniczne zakażenia płuc oraz zakażenia związane ze stosowaniem aparatury do wspomagania wentylacji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków sygnalizacyjnych między gospodarzem a patogenem oraz interakcji międzygatunkowych w kontekście fizjologicznym.
- Wspiera biologiczną ocenę ryzyka poprzez ujawnianie rekrutacji komórek odpornościowych i profili zapalnych podczas coinfekcji.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla interwencji modulujących interakcje mikrobiologiczne lub odpowiedzi immunologiczne.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowany system in vivo do dalszej analizy populacji komórek odpornościowych i obciążenia patogenami.
- Umożliwia ilościową ocenę nacieku neutrofili i makrofagów za pomocą płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.
- Umożliwia powtarzalny pomiar ładunku mikrobiologicznego i uszkodzeń tkanek w celu oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla chorób w przebiegu przewlekłych infekcji płuc oraz zapalenia płuc związanego z wentylacją mechaniczną.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację strategii przeciwdrobnoustrojowych lub immunomodulujących.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez modelowanie klinicznie istotnych interakcji patogenów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model in vivo stanowi pomost między wczesną fazą odkryć a badaniami przedklinicznymi, umożliwiając testowanie hipotez dotyczących interakcji mikrobiologicznych i immunologicznych w drogach oddechowych. Stanowi on platformę do identyfikacji wiodących kandydatów oraz ograniczania ryzyka mechanistycznego w biologii infekcji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera analizy oparte na hipotezach dotyczące interakcji patogenów między królestwami oraz modulacji odpornościowej.
- Screening: Dostarcza ilościowych danych na temat obciążenia patogenami i rekrutacji komórek odpornościowych do badań porównawczych.
- Analityka: Umożliwia analizę statystyczną ładunku mikrobiologicznego, infiltracji immunologicznej i uszkodzeń tkanek w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Modeluje klinicznie istotne scenariusze infekcji w celu oceny biomarkerów i terapii.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnia reużywalną platformę in vivo, którą można dostosować do innych badań polimikrobiologicznych lub interakcji gospodarz-patogen.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w biologii infekcji.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły zakażeń in vivo oraz odczyty immunologiczne w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wartość strategiczna: Stanowi podstawę do podejmowania decyzji go/no-go w programach przeciwzakaźnych i immunomodulacyjnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów ukierunkowanych na patologie polimikrobowe lub immunologiczne z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie mysich modeli infekcji oraz analizy komórek odpornościowych.
- Niezbędny jest dostęp do pomieszczeń dla zwierząt, protokołów bezpieczeństwa biologicznego oraz infrastruktury analitycznej do przetwarzania płuczyn i tkanek.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie przygotowania inokulum, czasu infekcji oraz pobierania próbek.
- Możliwa może być konieczność adaptacji protokołu dla różnych gatunków drobnoustrojów lub genetycznego tła gospodarza.
- Środki ostrożności są niezbędne podczas pracy z luminescencyjnym Candida lub czynnikami zakaźnymi.
