Metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych

Ogólnym celem tej metody jest zlokalizowanie i śledzenie migracji, ekspansji i przeżycia komórek macierzystych i progenitorowych w nabłonku rogówki. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek nabłonka rogówki dotyczące homeostazy, naprawy tkanek, starzenia się i patologii. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa do ustalenia i umożliwia nieinwazyjne śledzenie linii komórek w sposób klonalny.

Na początek najpierw wybierz transgeniczny szczep myszy Cree z indukowalnym promotorem specyficznym dla tkanki, aby oznaczyć komórki progenitorowe nabłonka rąbka i rogówki oraz komórki macierzyste. Stosowana jest linia Tamoxifen Inducible K 14 Cree ERT. Następnie należy dobrać odpowiednią kasetę brainbow w zależności od pytania badawczego i dostępnej linii Cree.

W tym przypadku używana jest linia Brainbow 2.1. Skrzyżowanie homozygotycznego szczepu konfetti R 26 R z homozygotycznym szczepem K 14 Cree ERT, aby wygenerować myszy z czterema kolorowymi komórkami dodatnimi K 14 Aby wywołać rekombinację u myszy transgenicznych. Najpierw zważyć 80 miligramów tamoksyfenu i rozpuścić go w jednym mililitrze oleju kukurydzianego przez wirowanie.

Umieść roztwór w wstrząsającej łaźni wodnej, utrzymywanej w temperaturze 65 stopni Celsjusza do całkowitego rozpuszczenia i pozostaw w kąpieli do czasu użycia następnego znieczulenia. Ośmiotygodniowa heterozygotyczna mysz Brainbow 2.1 Cree ERT i sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi, ostrożnie nałóż 100 mikrolitrów roztworu tamoksyfenu na każdą powierzchnię oka myszy. Bezpośrednie stosowanie tamoksyfenu zapewnia wysoką skuteczność indukcji Cree Wszelkie resztki roztworu tamoksyfenu należy chronić przed światłem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia.

Przed aplikacją należy ogrzać roztwór, który powtarza się przez trzy kolejne dni dla każdej myszy. Najpierw rozpuścić jeden gram proszku tamoksyfenu w pięciu mililitrach sterylnego sultlenku dimetylu. Aby uzyskać roztwór o stężeniu 200 miligramów na mililitr, umieść roztwór w wstrząsającej łaźni wodnej, utrzymuj go w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aż stanie się klarowny i pozostaw w kąpieli do czasu użycia.

Następnie znieczulij mysz i sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą szczypania palca u nogi, nałóż maść do oka nieleczonego myszy, aby uchronić je przed odwodnieniem podczas zabiegu i podaj odpowiednie leki przeciwbólowe. Następnie pobrać 200 mikrolitrów roztworu tamoksyfenu do strzykawki bez dołączonej igły i nałożyć go miejscowo na całą rogówkę oka. Ciecz krzepnie na tkance w temperaturze pokojowej.

Zajmij się myszą do momentu, gdy utrzyma mostek w pozycji leżącej i zwróć ją do towarzystwa innych tylko wtedy, gdy jest w pełni przytomna. Po złożeniu myszy w ofierze w odpowiednich punktach czasowych po indukcji, zranienie oka zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zajądrkuj oko, najpierw naciskając powiekę, aby wysunąć gałkę oczną z oczodołu.

Wsuń zakrzywione kleszcze za gałkę oczną, aby przytrzymać nerw wzrokowy i pociągnij gałkę oczną do góry, aby ją odłączyć. Umieść każdą gałkę oczną w 60-milimetrowym naczyniu zawierającym PBS. Umieść płytkę zawierającą oko pod chirurgicznym mikroskopem stereoskopowym.

Upewnij się, że rozpoznajesz podstawową strukturę oka, rogówkę, rąbek i nerw wzrokowy. Usuń nerw wzrokowy, mięśnie i tkankę łączną wokół oka. Przytrzymaj oko w tylnej części rogówką skierowaną w dół i wykonaj nacięcie w twardówce z tyłu gałki ocznej za pomocą nożyczek sprężynowych.

Powiększ nacięcie, aby obiektyw wyskoczył i usuń tęczówkę za pomocą kleszczy. Następnie wykonaj cztery do pięciu promieniowych nacięć, przecinając od środka w kierunku obwodu, aby spłaszczyć rogówkę, a następnie usuń wszelkie pozostałe części tęczówki cienką płaską szpatułką. Na koniec odetnij nadmiar tkanki obwodowej otaczającej rąbek, aby naprawić rogówkę.

Przenieś wypreparowaną tkankę do naczynia z 12 dołkami i inkubuj ją w 4% para formaldehydu przez 10 minut. Następnie krótko umyj tkankę w PBS, aby wybarwić jądra komórkowe. Inkubować rogówkę w dwóch mikrogramach na mililitr roztworu DPI przez 10 minut, a następnie krótko przemyć w PBS.

Następnie umieść rogówkę na szkiełku podstawowym stroną nabłonkową skierowaną do góry. Następnie umieść kroplę podłoża montażowego na rogówce i przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Do obrazowania rogówki należy użyć spektralnego systemu konfokalnego, który umożliwia separację emisji R-F-P-Y-F-P-G-F-P i CFP. Najpierw ustaw długości fal fluorescencji, wzbudzenia i emisji w zależności od białek fluorescencyjnych w mózgu. Kaseta Bo, dbając o to, aby zapobiec wzbudzeniu krzyżowemu lub nakładaniu się sygnałów emisyjnych.

Następnie uzyskaj obrazy kafelkowe, aby zwizualizować całą rogówkę w wysokiej rozdzielczości. Tutaj uzyskaj tablicę obrazów 12 na 12 we wszystkich czterech kanałach fluorescencyjnych. Na koniec scal obrazy, aby utworzyć złożoną linię.

Eksperymenty śledzące z użyciem myszy konfetti R 26 R przeprowadzono w celu śledzenia losu komórek progenitorowych nabłonka rąbka i rogówki. W warunkach stanu stacjonarnego małe skupiska komórek fluorescencyjnych obserwowano 10 dni po indukcji, zgodnie z oczekiwaniami. Po czterech miesiącach pojawiły się smugi od rąbka do środka rogówki, co sugeruje, że komórki migrują z rąbka rogówki, aby zregenerować rogówkę po uszkodzeniu rogówki.

Migracja z rąbka nastąpiła gwałtownie, a długie, grube paski rąbka rozwinęły się w ciągu siedmiu dni. Model ten jest cenny do śledzenia i badania komórek macierzystych i progenitorowych rogówki w różnych okolicznościach. Umożliwi to w przyszłości badanie ekspansji, przeżycia i migracji komórek klonalnych w stanie stacjonarnym i w warunkach stresowych, takich jak zranienia, mutacje chemiczne i inne.

Model ten może być również wykorzystany do analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw prawidłowej i patologicznej regeneracji rogówki. Technika ta może przyczynić się do zrozumienia różnych stanów patologicznych, takich jak dystrofie rogówki, oparzenia i urazy rogówki, a także do oceny wpływu różnych metod leczenia na regenerację rogówki, ekspansję komórek i migrację.