Ekspresja transgenu za pośrednictwem HSV konstruktów chimerycznych w celu zbadania funkcji behawioralnej heteromerów GPCR u myszy

Ogólnym celem tej metody jest obserwacja, w jaki sposób transfer genów za pośrednictwem wirusa wpływa na fenotypy behawioralne, które wymagają heterodimeryzacji receptorów sprzężonych z białkiem G w modelach mysich. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neurofarmakologii i psychofarmakologii. W szczególności, w jaki sposób receptory sprzężone z białkiem g oddziałują ze sobą na poziomie molekularnym.

Stosując tę metodę możemy zrozumieć, jak ta interakcja wpływa na zachowanie w modelach zaburzeń psychicznych, takich jak schizofrenia i depresja. Korzystając z tej metody, przyjrzymy się w szczególności seratoninie 2a i metabotropowemu receptorowi glutaminianu 2, które, jak wykazano, są zaangażowane w mechanizm działania leków stosowanych w leczeniu pacjentów ze schizofrenią. Zacznij od odpowiedniego znieczulenia myszy zgodnie z zatwierdzonymi metodami.

Upewnij się, że uzyskano chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palca u nogi i odnotowując brak odpowiedzi. Następnie nałóż żel okulistyczny, aby chronić oczy. Przymocuj mysz do ramki stereotaktycznej, upewniając się, że wyregulowałeś nachylenie głowy tak, aby czaszka była wypoziomowana i płaska.

Nałóż jod powidonu na odsłoniętą skórę głowy. Za pomocą skalpela wykonaj strzałkowe nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki w odsłoniętym ogolonym obszarze. Następnie przymocuj klamry pureit do skóry w miejscu nacięcia, aby upewnić się, że czaszka pozostaje odsłonięta.

Zastosuj nadtlenek wodoru, aby rozpuścić okostną i odsłonić szwy czaszki. Teraz, gdy bregma i szwy są widoczne, pamiętaj o wyregulowaniu ramy stereotaktycznej, aby upewnić się, że czaszka jest wypoziomowana. Wyrównać końcówki igieł strzykawek z bregma i zanotować współrzędne bregmy.

Aby obustronnie wstrzyknąć korę czołową, dodaj 1,6 mm do zarejestrowanej współrzędnej bregmy ogonowej rostralnej i 2,6 mm do zarejestrowanej współrzędnej bregmy bocznej przyśrodkowej. Zaznacz miejsca wstrzyknięć na czaszce, a następnie wywierć małe otwory w miejscach wstrzyknięcia. Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką zetrzyj nadmiar krwi lub fragmenty kości.

Przyłóż igłę do powierzchni mózgu i obniż na głębokość grzbietowej współrzędnej brzusznej. Następnie powoli wstrzyknąć zawartość strzykawki, przekręcając tłok igły, aby podawać 0,1 mikrolitra na minutę przez pięć minut, do wstrzyknięcia 0,5 mikrolitra. Pozostawić strzykawkę na miejscu przez pięć minut.

Po wyznaczonym czasie wyjmij zwierzę ze stereotaksji, zamknij nacięcie i umieść na podkładce rozgrzewającej. Podaj analgezję pooperacyjną zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt. Wykonaj testy behawioralne dwa do trzech dni po stereotaktycznym wstrzyknięciu cząstek wirusa.

Przyzwyczaj myszy do pokoju na co najmniej cztery godziny przed rozpoczęciem eksperymentu. Zacznij od rozpuszczenia DOI w 0,9-procentowym roztworze soli fizjologicznej do dwóch miligramów na kilogram. Przygotuj klatkę domową bez pościeli i za pomocą statywu wyreguluj kamerę tak, aby znajdowała się bezpośrednio nad klatką domową.

Skalibruj kamerę tak, aby cała klatka domowa znajdowała się w polu view. Zważyć mysz i wstrzyknąć dootrzewnowo odpowiednią dawkę 0,9 procent soli fizjologicznej lub DOI. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej na dziesięć minut.

Po dziesięciu minutach umieść mysz na środku pustej klatki domowej i upewnij się, że w polu widzenia kamery nie ma martwych punktów. Naciśnij przycisk nagrywania na kamerze i opuść pomieszczenie. Po 30 minutach zatrzymaj nagrywanie i umieść mysz z powrotem w oryginalnej klatce domowej.

Powtórz test behawioralny na następnej myszy. Niech sędzia przejrzy filmy bez względu na warunki eksperymentalne. Ręcznie nagrywaj każde drgnięcie głowy w całym filmie.

Drganie głowy definiuje się jako szybki ruch potrząsania głową wykonywany przez mysz. Przetwarzaj dane zgodnie z opisem w pisemnej części protokołu. Pokazany tutaj jest reprezentatywny obraz ekspresji transgenu za pośrednictwem HSV w korze czołowej.

HSV mGlu2 GFP wstrzyknięto do kory czołowej, a ekspresję GFP ujawniono za pomocą immunocytochemii. Ta podziałka reprezentuje 200 mikronów. Ten obraz pokazuje western blot ekspresji transgenu za pośrednictwem HSV i reaktywności anty-mGlu2 w korze czołowej myszy z nokautem mGlu2.

Tutaj zmierzyliśmy immunoreaktywność mGlu2 jako monomeru. Ten histogram pokazuje, że ekspresja mGlu2 za pośrednictwem wirusa, ale nie chimerycznego mGlu2 w korze czołowej myszy z nokautem mGlu2, znacząco ratuje reakcję skurczu głowy wywołaną przez halucynogennego agonistę receptora seratoniny 2a DOI. Najbardziej krytycznymi krokami w tym eksperymencie są czas między zastrzykami wirusa, reakcja drgania głowy i kiedy myszy są składane w ofierze.

Każde opóźnienie może zmienić wyniki eksperymentu lub wprowadzić niejednoznaczność do danych. Po opanowaniu, operacja na myszach zajmie około 30 minut, aby wstrzyknąć wirusa. Eksperyment z drganiem głowy powinien również trwać około 35 minut na mysz.

Zaleca się przeprowadzanie operacji rozłożonych w czasie lub operowanie na więcej niż jednej myszy na raz. W ten sposób można utrzymać oś czasu, która pozwala na przeprowadzenie eksperymentów z drganiem głowy w ciągu trzech do czterech dni po operacji, co jest szczytowym czasem ekspresji konstruktu wirusowego. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymencie.