Immunomagnetyczna separacja komórek macierzystych o^{wysokiej zawartości} tkanki tłuszczowej (ASC) Sca1 specyficznych dla Fat Depot

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych wykazujących ekspresję Sca1 z różnych podskórnych zapasów tłuszczu myszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki zastosowaniu sortowania komórek opartego na koralikach immunomagnetycznych można skutecznie wzbogacić populację komórek macierzystych pochodzenia tłuszczowego z różnych depotów tłuszczowych na potrzeby dalszych eksperymentów. Zazwyczaj badacze rozpoczynający pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ siła i czas trwania trawienia tkanki kolagenazą muszą zostać zoptymalizowane, aby uzyskać odpowiednią liczbę komórek do sortowania.

Aby wyizolować tkankę tłuszczową podskórną, należy umieścić mysz w pozycji grzbietowej na piankowej desce sekcyjnej i spryskać zwierzę 70% ethanol. Po przymocowaniu łap do deski, należy wykonać niewielkie nacięcie skóry w dolnej części brzucha. Następnie, chwytając górną krawędź nacięcia pęsetą, należy za pomocą nożyczek oddzielić skórę i otrzewną od brzucha aż do klatki piersiowej.

Wykonując nacięcia poprzeczne skóry wzdłuż boku ciała, odchyl skórę od otrzewnej w kierunku głowy. Następnie odsun pozostałą skórę, odciągając tłuszcz pachwinowy od ciała, i za pomocą igieł o rozmiarze 22 G przypnij skórę do podkładki. W kolejnym kroku, używając pęsety, chwyć jedną poduszkę tłuszczu pachwinowego u jej nasady w pobliżu otrzewnej, a następnie za pomocą drobnych nożyczek przecinaj tkankę między skórą a tłuszczem pachwinowym, przesuwając się w stronę pachwiny, unikając zanieczyszczenia podskórnej poduszki tłuszczowej skórą.

Następnie wyizolowaną podskórną tkankę tłuszczową z pachwiny umieść w opisanej jako SQ szalce o średnicy 60 mm zawierającej pożywkę hodowlaną o temperaturze 37 °C, a następnie w ten sam sposób pobierz tkankę tłuszczową z pachwiny z drugiej strony ciała zwierzęcia. Aby wyizolować trzewną tkankę tłuszczową, przetnij otrzewną, aby odsłonić trzewną tkankę tłuszczową i jelita. Następnie odsuń jelita w stronę klatki piersiowej.

Chwyć podskórną tkankę tłuszczową za jej dystalny koniec, delikatnie pociągnij tkankę tłuszczową do góry i wypreparuj ją, uważając, aby nie dołączyć tkanki najądrza. Następnie umieść tkankę tłuszczową w 60 mm szalce oznakowanej jako VIS, zawierającej pożywkę hodowlaną o temperaturze 37 °C. Po zebraniu wszystkich fragmentów tkanki tłuszczowej przenieś szalki do komory z laminarnym przepływem powietrza i odessij pożywkę.

Za pomocą zakrzywionych nożyczek rozdrobnij poduszeczki tłuszczowe. Następnie przenieś kawałki tłuszczu do poszczególnych probówek o pojemności 50 ml zawierających świeżo przygotowaną kolagenazę. Następnie inkubuj probówki wstrząsając je przy 300 RPM w temperaturze 37 °C przez 10 do 20 minut, aż tkanki zostaną strawione.

Niektóre fragmenty tkanki podskórnej poduszki tłuszczowej mogą być nadal widoczne. Do roztworu kolagenazy należy dodać 20 ml pożywki hodowlanej, aby zatrzymać proces trawienia, a następnie za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml 10 razy aspirować i wydmuchiwać zawiesinę tkankową, aby całkowicie rozdzielić strawione tkanki. Komórki należy przefiltrować przez sita komórkowe o oczkach 100 µm, a następnie poddać tkanki wirowaniu.

Następnie ostrożnie odlej pożywkę, dbając o to, aby nie naruszyć osadów, i delikatnie resuspenduj obie grupy komórek w pięciu mililitrach sterylnej wody. Odczekaj dwie minuty do czasu lizy erytrocytów. Następnie zatrzymaj reakcję w każdej probówce, dodając 25 mililitrów pożywki uzupełnionej o FBS.

Przefiltruj obie populacje adipocytów przez nowe sitka komórkowe o oczkach 100 µm, ponownie je odwiruj, a następnie resuspenduj osady w 1–3 mL pożywki. Po zliczeniu komórek metodą wykluczania błękitu trypanu, wysiej oddzielnie 1×10⁶ komórek z tkanki tłuszczowej podskórnej oraz komórek z tkanki tłuszczowej trzewnej do poszczególnych studzienek 6-dołkowej płytki hodowlanej. Po trypsynizacji komórek rozcieńcz trypsynę 1 mL buforu separacyjnego, a następnie odwiruj płytki hodowlane.

Komórki zawieszamy w 500 µL buforu separacyjnego na probówkę i ponownie wirujemy. Następnie komórki resuspendujemy w 90 µL buforu separacyjnego na probówkę i dodajemy do zawiesiny komórkowej 10 µL przeciwciała pierwszorzędowego anty-Sca1 FITC. Po 10 minutach inkubacji w temperaturze 4 °C w ciemności komórki przemywamy 1 ml buforu separacyjnego na probówkę.

Po wirowaniu komórki resuspensuje się w 80 µL buforu separacyjnego na każdą zawiesinę komórkową. Następnie do każdej studni dodaje się 20 µL mikrokulek Anti-FITC, a płytki inkubuje w temperaturze 4 °C, w ciemności, przez 15 minut. Po zakończeniu inkubacji komórki przemywa się w 1 mL buforu separacyjnego, a następnie resuspensuje w 500 µL świeżego buforu na probówkę.

Następnie umieść kolumnę w uchwycie magnetycznym i przepłucz ją 500 µL buforu separacyjnego. Przenieś komórki z hodowli tkankowej podskórnej tkanki tłuszczowej na kolumnę, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza, a nieoznakowane komórki Sca1 ujemne zbierz do 15 ml probówki stożkowej. Po przejściu wszystkich komórek przemyj kolumnę trzykrotnie 500 µL buforu separacyjnego.

Następnie przenieś kolumnę z magnesu do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów i przepuść jeden mililitr świeżego buforu separacyjnego przez kolumnę, aby eluować komórki Sca1 dodatnie. Na koniec odwirowuj obie frakcje komórek Sca1 dodatnich i ujemnych, a otrzymane osady resuspenduj w jednym mililitrze pożywki hodowlanej. Następnie policz liczbę komórek w każdej frakcji i wysiej je do oddzielnych studni nowej sześciostudzienkowej płytki hodowlanej.

Komórki zrębowe naczyń izolowane z tkanki tłuszczowej podskórnej wykazują fibroblastopodobny, wydłużony kształt niezależnie od poziomu ekspresji Sca1. Podobnie jak komórki Sca1 high pochodzące z tkanki tłuszczowej podskórnej pachwinowej, komórki Sca1 high pochodzące z tkanki tłuszczowej trzewnej nadjądrzowej wykazują wydłużony, fibroblastopodobny kształt. Natomiast komórki VIS Sca1 low wykazują kształt nabłonkowy.

Komórki o wysokiej ekspresji Sca1 wyizolowane z myszy Sca1-GFP są łatwo identyfikowalne jako komórki GFP-dodatnie w hodowli tkankowej. Rzeczywiście, podczas oceny tych komórek metodą cytometrii przepływowej potwierdzono, że większość komórek GFP-dodatnich wykazuje ekspresję białek Sca1 na powierzchni komórkowej, co wykryto za pomocą przeciwciała anty-Sca1. W połączeniu z analizami RT-PCR można wykazać różnicową ekspresję kolagenolitycznych metaloproteinaz macierzy pomiędzy komórkami macierzystymi pochodzenia tłuszczowego o wysokiej ekspresji Sca1 pochodzącymi z tkanki tłuszczowej pachwinowej i nadjajowodowej.

Ponadto, gdy żele kolagenu typu I znakowane fluoresceiną są wykorzystywane do oceny aktywności degradacji pericelularnej, obserwuje się wyraźnie zwiększoną aktywność przebudowy kolagenu pośredniczoną przez trzewne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej o wysokiej ekspresji Sca1. Po opanowaniu techniki izolacja komórek z tkanki tłuszczowej może zostać ukończona w ciągu dwóch godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby dbać o czystość i organizację pola operacyjnego, co zapewni wydajną izolację tkanki tłuszczowej.

Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak test degradacji kolagenu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące przebudowy tkanki pośredniczonej przez komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie otyłości i biologii macierzy do badania roli komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w przebudowie i funkcjonowaniu tkanki tłuszczowej u myszy i ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak pozyskiwać i wzbogacać pierwotne komórki Sca1-dodatnie z depotów tkanki tłuszczowej.