Chirurgiczne unerwienie skóry: metoda badania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach choroby skóry
26 czerwca 2016
Ten artykuł zawiera szczegółowe protokoły genetycznego znakowania skóry myszy, chirurgicznego odnerwienia, biopsji skóry i wizualizacji oznakowanego nabłonka za pomocą barwienia β-galaktozydazą metodą całego montażu. Metody te można wykorzystać do badania zapotrzebowania na nerwy w mysich modelach normalnej i patologicznej skóry.
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie wpływu nerwów na skórę zdrową i patologiczną. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii normalnej skóry, takie jak to, czy nerwy skórne wpływają na homeostazę i rozwój chorób. Główną zaletą tej techniki jest możliwość porównania próbek skóry nienaruszonej i odnerwionej pochodzących od tego samego zwierzęcia.
Wizualna demonstracja tej techniki jest kluczowa, ponieważ nerwy mogą być trudne do zidentyfikowania i usunięcia przy minimalnym uszkodzeniu otaczających tkanek. Najpierw znieczul mysz i sprawdź za pomocą ucisku palca u nogi, czy zwierzę osiągnęło odpowiedni poziom sedacji. Potwierdź również, że mysz wykazuje prawidłowy oddech i tętno.
Następnie umieść zwierzę na podkładce grzewczej w aseptycznym obszarze chirurgicznym. Za pomocą elektrycznej strzyżarki ostrożnie usuń sierść z grzbietu w miejscu, z którego pobierana będzie biopsja. Następnie przemyj ogoloną okolicę za pomocą gazików z Betadyne i alkoholem.
Należy upewnić się, że z miejsca zabiegu usunięto wszystkie obryte włosy. Następnie należy obrysować miejsce biopsji czarnym markerem. Aby uzyskać przekroje podłużne mieszków włosowych, dłuższy brzeg miejsca biopsji powinien przebiegać w kierunku przednio-tylnym, równolegle do linii środkowej grzbietu.
Za pomocą skalpela wykonaj wycięcie o pełnej grubości, nie uszkadzając znajdującej się pod spodem powięzi mięśniowej. Krwawienie jest zazwyczaj minimalne. Próbka do biopsji powinna obejmować naskórek, skórę właściwą, tkankę tłuszczową podskórną oraz panniculus carnosus.
Wygładzić wycięty fragment skóry na suchym ręczniku papierowym, stroną skóry właściwej do dołu. Odciąć nadmiar ręcznika papierowego i przechowywać próbkę w zimnym TBS przez maksymalnie godzinę, jeśli konieczne jest pobranie innych próbek. Następnie zaszyć miejsce biopsji u myszy, używając nylonowych nici chirurgicznych 60 w odstępach około trzech milimetrów.
Następnie monitoruj mysz w klatce rekonwalescencyjnej aż do odzyskania przez nią przytomności. Stosuj leki przeciwbólowe zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej opieki nad zwierzętami i postępuj zgodnie z nimi, jeśli mysz wykazuje oznaki stresu. W ciągu siedmiu do 10 dni po operacji usuń szwy.
Przejdź do opracowania biopsji w celu wykonania badań histologicznych lub barwienia całych preparatów (whole-mount). Znieczul zwierzę, ogól całą skórę grzbietową i oczyść ten obszar w sposób analogiczny do procedury biopsji. Następnie, używając sterylnego skalpela, wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej grzbietu, od podstawy szyi do miejsca położonego około pół centymetra powyżej ogona.
Używając sterylnej pęsety tępej, ostrożnie odsunąć skórę z lewej strony od boku, aby uwidocznić leżące poniżej tkanki, od podłojowych poduszek łopatkowych w okolicy szyi aż do miejsca tuż nad kończyną tylną. Następnie zidentyfikować grzbietowy nerw skórny pod stereotypem. Mają one postać białych pasm biegnących w kierunku ogonowym przez półprzezroczystą powięź ściany tułowia, po czym gwałtownie zginają się i wchodzą w luźną tkankę łączną pod skórą.
Następnie, używając pęsety ultrafine, usuń nerwy wyłącznie z lewej strony zwierzęcia, zlokalizowane w miejscach anatomicznych od T3 do T12, wyciągając je z miejsca, w którym ich segmenty zginają się przy ścianie tułowia, aż do miejsc ich wniknięcia w skórę. Ustaw pęsetę pionowo i chwyć nerwy około pół centymetra poniżej miejsc ich zgięcia. Po uchwyceniu pociągnij w górę, aby nerwy się rozciągnęły i oddzieliły od otaczających tkanek, co umożliwi ich usunięcie.
Należy unikać uszkodzenia sąsiednich naczyń krwionośnych. Należy zadbać o to, aby tkanka pozostała wilgotna przez cały czas trwania procedury, okresowo aplikując krople 0.9% roztworu soli fizjologicznej. Należy kontynuować usuwanie wszystkich nerwów biegnących od ściany tułowia do skóry, unikając jednak naruszenia nerwów znajdujących się w gęstej powięzi ściany tułowia.
Następnie usuń wszelkie nerwy z odsłoniętego płata skóry. Włókna te stanowią gałęzie dystalne nerwu skórnego grzbietowego i występują jako białe, rozgałęzione pasma rozmieszczone sporadycznie w tkance łącznej po stronie skórnej płata. Aby usunąć te cienkie gałązki, ustaw pęsetę mniej więcej równolegle do powierzchni skóry, chwyć nerw i pociągnij go do góry.
W ten sposób usuń wszystkie widoczne nerwy. Nie przebijaj naczyń krwionośnych ani skóry. Na tym etapie ważne jest, aby uniknąć przerwania sąsiednich naczyń krwionośnych.
Jeśli znajdziesz nerw z sąsiadującym naczyniem krwionośnym, podążaj wzdłuż niego, aż dojdziesz do obszaru, w którym nie ma sąsiadującego naczynia, a następnie usuń go poprzez wyrywanie. Teraz rozluźnij skórę po prawej stronie nacięcia wzdłuż linii środkowej grzbietu, ale nie usuwaj żadnych nerwów. Będzie to służyć jako przeciwstronna kontrola operacji pozorowanej.
Na koniec zaszyj ranę u zwierzęcia i monitoruj jego stan pooperacyjny w taki sam sposób jak wcześniej. Następnie, aby potwierdzić trwałą utratę unerwienia, kilka tygodni po zabiegu, delikatnie nakłuj odnerwiony obszar za pomocą sterylnej igły hipodermicznej. Zwróć uwagę, czy zwierzę reaguje, zazwyczaj poprzez drżenie lub odwracanie głowy.
Jeśli obszar skóry został trwale pozbawiony unerwienia, zwierzę wykaże minimalną reakcję lub jej brak. Pobierz biopsje skóry z obszaru braku reakcji oraz z przeciwległej strony poddanej zabiegowi pozorowanemu (sham), aby uzyskać dopasowane próbki eksperymentalne i kontrolne. Z pobranych biopsji ważne jest przygotowanie wielu przekrojów histologicznych, aby zidentyfikować potencjalne różnice w liczebności lub morfologii kopułek dotykowych między preparatami kontrolnymi a pozbawionymi unerwienia.
Linia myszy glebe one cree ERT2 umożliwia ukierunkowanie indukowanej tamoksyfenem rekombinacji genetycznej na obszary skóry wykazujące wysoką aktywność szlaku hedgehog, takie jak nabłonek kopułek dotykowych. Myszy te krzyżowano z myszami reporterowymi induce abolaxi w celu wizualizacji nabłonka kopułek dotykowych. Węzły są kluczowe dla utrzymania zarówno prawidłowych kopułek dotykowych, jak i powiązanych z nimi komórek Merkla.
Zostało to wykazane eksperymentalnie poprzez stopniową utratę prawidłowej morfologii kopułek dotykowych, a także utratę komórek z odłożoną keratyną 8 po denerwacji. Nerwy są również kluczowe dla promowania sygnalizacji hedgehog w kopułce dotykowej, co monitorowano za pomocą ekspresji Glebe one cree ERE2 oraz barwienia home-mount beta collective sided w skórze pozorowanej i denerwowanej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak chirurgicznie ablują grzbietowe nerwy skórne, aby sprawdzić, czy nerwy te są zaangażowane w prawidłowe funkcjonowanie skóry lub czy modulują one przebieg choroby.
Po opanowaniu ta technika może być wykonywana rutynowo i wiarygodnie, przy minimalnym stresie dla zwierzęcia. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować metody takie jak barwienie aminofluorescencyjne, aby potwierdzić, czy nerwy zostały całkowicie usunięte ze skóry oraz czy ekspresja genów uległa zmianie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokoły genetycznego znakowania skóry myszy, chirurgicznej denerwacji oraz biopsji skóry, wraz z metodami wizualizacji znakowanych nabłonków poprzez barwienie całych preparatów na $\beta$-galaktozydazę. Techniki te są niezbędne do badania roli nerwów w prawidłowych i patologicznych stanach skóry.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Dermatologia
- Patologia
Wstęp
- Zrozumienie wpływu nerwów na biologię skóry jest kluczowe.
- Nerwy skórne mogą odgrywać rolę w homeostazie skóry oraz w procesach chorobowych.
- Analiza porównawcza skóry nienaruszonej i odnerwionej może dostarczyć cennych informacji.
- Ze względu na trudności w rozpoznawaniu nerwów niezbędne jest zastosowanie technik wizualizacyjnych.
Cel badania
- Badanie roli nerwów w prawidłowej biologii skóry.
- Ocena wpływu nerwów na patologiczne stany skóry.
- Opracowanie wiarygodnych metod identyfikacji i usuwania nerwów.
Zastosowane metody
- Genetyczne znakowanie skóry myszy.
- Techniki chirurgicznej denerwacji.
- Procedury biopsji skóry.
- Barwienie całego preparatu na β-galaktozydazę w celu wizualizacji.
Główne wyniki
- Zaprezentowano metody identyfikacji nerwów w próbkach skóry.
- Przedstawiono protokoły porównawcze dla skóry odnerwionej i nienaruszonej.
- Podkreślono znaczenie obecności nerwów dla zdrowia skóry.
- Umożliwiono dalsze badania nad oddziaływaniami między nerwami a skórą.
Wnioski
- Nerwy wywierają znaczący wpływ na biologię i patologię skóry.
- Opracowane techniki mogą zwiększyć zrozumienie funkcji nerwów.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych metodach w celu uzyskania głębszych informacji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia bezpośrednie porównanie skóry unerwionej i odnerwionej u tego samego zwierzęcia, zapewniając kontrolowane podejście do oceny mechanizmów zależnych od nerwów w homeostazie skóry i procesach chorobowych. Poprzez izolację zmiennej w postaci obecności nerwów, metoda ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w walidacji celów dla szlaków dermatologicznych. Technika ta ma zastosowanie w modelach mysich patologii skóry, oferując znaczenie translacyjne dla przedklinicznej oceny interakcji neurokutaneousnych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących sygnalizacji nerwowo-skórnej w skórnych organach mechanosensorycznych, takich jak kopułki dotykowe.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów neuronalnych poprzez porównanie grup odnerwionych z grupami kontrolnymi (sham) o identycznym tle genetycznym.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów badawczych poprzez wyjaśnienie, czy cele neuronalne napędzają patologię, czy homeostazę w modelach chorób skóry.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zestandaryzowane systemy biologiczne z mierzalnymi wynikami, takimi jak morfologia kopuły dotykowej i ekspresja genów, do przesiewania związków.
- Powtarzalność: Umożliwia uzyskanie dopasowanych próbek doświadczalnych i kontrolnych od tego samego zwierzęcia, co redukuje zmienność międzyosobniczą w wynikach analizy.
- Skalowalność: Pozwala na wielokrotne pobieranie próbek w czasie w celu monitorowania postępu choroby, co wspiera podłużny projekt analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w chorobach: Możliwość adaptacji do mysich modeli patologii skóry, w tym atopowego zapalenia skóry, łuszczycy i nowotworów, w celu przetestowania zależności od nerwów.
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez utrzymanie spójnej manipulacji nerwami w poszczególnych fazach badania.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Stanowi podstawę kryteriów postępu badań poprzez określenie, czy zaobserwowane fenotypy wymagają nienaruszonego unerwienia.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania, obejmujące testowanie hipotez dotyczących punktów uchwytu, identyfikację związków wiodących oraz walidację przedkliniczną, w szczególności w odniesieniu do szlaków neuroimmunologicznych lub neuroepithelialnych w skórze.
- Biologia odkrywcza: Pozwala sprawdzić, czy nerwy skórne są niezbędne do utrzymania kopułek dotykowych lub ekspresji genów, co wspomaga ograniczanie ryzyka w badaniach nad szlakami sygnałowymi.
- Przesiewanie: Umożliwia uzyskanie próbek skóry odnerwionej i nienaruszonej, odpowiednich do standaryzowanego barwienia całych preparatów oraz odczytów opartych na obrazowaniu.
- Analityka: Umożliwia ilościowe porównanie punktów końcowych strukturalnych i molekularnych między różnymi warunkami w celu oceny istotności biologicznej.
- Badania translacyjne: Wykorzystuje ablację nerwów w modelach chorób do oceny ciągłości mechanizmów zależnych od nerwów od etapu odkrywania po etapy przedkliniczne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę manipulacji nerwami z możliwością ponownego wykorzystania, którą można zastosować w wielu modelach chorób skóry i klasach celów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez izolację wpływu nerwów na fenotypy skóry.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procedury usuwania nerwów oraz grupy kontrolne, co poprawia odtwarzalność wyników między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez potwierdzenie oddziaływania na cel w kontekście istotnym patofizjologicznie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów neurokutaneousnych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wymagania funkcjonalne w modelach chorobowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga biegłości w technikach mikrochirurgicznych i identyfikacji nerwów pod mikroskopem sekcyjnym.
- Zależność od sterylnej infrastruktury chirurgicznej oraz protokołów opieki pooperacyjnej nad zwierzętami.
- Konieczność standaryzacji zakresu denerwacji i metod walidacji (np. testów sensorycznych) pomiędzy użytkownikami.
- Przy interpretacji danych podłużnych należy uwzględnić zmienność w regeneracji nerwów lub innerwacji kompensacyjnej.
- Ograniczenie do dostępnych obszarów skóry grzbietowej; adaptacja do innych miejsc może wymagać zmodyfikowanych podejść chirurgicznych.
