Izolacja i ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych pochodzących z ludzkiej tkanki łożyska

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja i namnażanie mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki łożyska ludzkiego. Cześć, jestem Mike Doran. Jestem liderem grupy na Queensland University of Technology w Translational Research Institute w Brisbane w Australii.

Witam, nazywam się Rebecca Pelekanos i jestem badaczką w Centrum Badań Klinicznych Uniwersytetu w Queensland. Dzisiaj zaprezentuję procedurę izolacji MSC. Łożyska są zazwyczaj utylizowane po porodzie.

Ze względu na to, że tkanka ta waży od 5 do 700 gramów, stanowi wyjątkowo bogate źródło allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające izolację MSC z łożyska napotykają trudności z powodu braku znajomości anatomii łożyska, nieznajomości metod przetwarzania tkanki oraz braku wiedzy na temat tego, jaki typ komórek – matczyne czy płodowe – będzie zasiedlać końcową kulturę MSC. Aby pomóc badaczom, w tym filmie omawiamy te istotne szczegóły.

Pierwszym krokiem w tej procedurze jest zapoznanie się z anatomią łożyska. Drugim krokiem jest ręczne wycięcie 10 g tkanki z błony jamaczej, kosmków chorionu lub blaszki chorionicznej za pomocą nożyczek. Te dwa pierwsze kroki zostały tutaj ponownie przedstawione schematycznie.

W kroku trzecim tkanki błony basalnej, kosmki pozapłodowe lub tkanki płytki chorialnej są dalej rozdrabniane nożyczkami na drobne fragmenty. W kroku czwartym komórki są uwalniane z małych fragmentów tkanek poprzez jedno- do dwugodzinne trawienie w dyspazie i kolagenazie I. W kroku piątym komórki są oddzielane od tkanki włóknistej poprzez przemycie ich przez sitko komórkowe. Następnie komórki są zbierane, resuspenderowane w medium hodowlanym i przenoszone do kolb hodowlanych.

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs) zostaną wyselekcjonowane na podstawie ich zdolności do przylegania do tworzywa sztucznego oraz zdolności do przeżycia i proliferacji w pożywce hodowlanej. W sekcji wyników namnożone MSC mogą zostać scharakteryzowane i zamrożone do wykorzystania w przyszłych eksperymentach. Łożysko jest narządem tymczasowym, który umożliwia wymianę składników odżywczych i produktów przemiany materii między płodem a matką podczas ciąży.

Łożysko można łatwo pobrać aseptycznie po cesarskim cięciu i bezpiecznym urodzeniu dziecka. Łożysko składa się głównie z naczyń krwionośnych i błon pochodzenia płodowego. Zawiera ono jednak również niektóre komórki macierzyńskie.

Łożysko jest połączone z macicą zarówno za pomocą macierzyńskich komórek decydualnych pochodzących z macicy, jak i płodowych, naciekających trofoblastów. Zazwyczaj nie jest możliwe rozróżnienie gołym okiem dokładnej granicy między tkankami macierzyńskimi a płodowymi. Jednak stronę płodową łożyska można łatwo zidentyfikować jako stronę, po której znajduje się pępowina.

Po urodzeniu dziecka do łożyska przylega jedynie cienka warstwa tkanki decydualnej. Dzięki orientacji anatomicznej łożyska możliwe jest zlokalizowanie trzech tkanek, które pobierzemy dzisiaj. Pierwszą pobieraną tkanką będzie decidua macierzysta.

Zielony znacznik wskazuje na tkankę decydualną, która pozostaje na powierzchni po oddzieleniu łożyska od ściany macicy. Drugą tkanką, która zostanie pobrana z wnętrza łożyska, są płodowe kosmki błonowe. Zostały one zaznaczone na schematach niebieskimi okręgami.

Trzecią pobieraną tkanką będzie płodowa płytka kosmiczna. Tkanka ta jest oznaczona czerwonymi markerami na schematach. Dobrze, zacznijmy.

Umieść łożysko w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Rozwiń błony płodowe i zapoznaj się z budową łożyska. Strona płodowa z miejscem przyczepu pępowiny, błona chorioamniotyka lub worek owodniowy.

Powierzchnia płodowa łożyska posiada wyraźne duże naczynia krwionośne w płytce chorionowej, przykryte błoną amniotyczną, którą również można łatwo oddzielić mechanicznie. Strona macierzysta znajduje się naprzeciwko strony płodowej i charakteryzuje się wyraźnymi kotyledonami lub płatami. Należy upewnić się, że powierzchnia macierzysta jest skierowana do góry.

Wytnij kawałki o grubości 0,5 cm z macicznej strony łożyska lub z decidua. Podczas sekcji umieść fragmenty tkanek w szalce Petriego zawierającej zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS), aby utrzymać ich wilgotność. Wymieszaj tkanki w naczyniach z HBSS, aby usunąć nadmiar krwi.

Przenieś wystarczającą ilość tkanki, aby wypełnić probówkę do poziomu 10 mililitrów w probówce o pojemności 50 mililitrów, co odpowiada w przybliżeniu 10 gramom. Należy pamiętać, że na tym etapie można wyizolować więcej tkanki, jeśli pod koniec procedury wymagana będzie większa liczba komórek. Upewnij się, że powierzchnia płodowa jest skierowana do góry.

Mechanicznie usuń błonę płodową z powierzchni płodowej łożyska, pozostawiając nienaruszoną płytkę choryoniczną. Potnij płytkę choryoniczną na pasy, wcinając się w tkankę kosmkową na głębokość około połowy centymetra. Następnie wyciąć tkankę kosmków choryonicznych na głębokość około jednego centymetra w głąb łożyska z miejsca, z którego usunięto płytkę choryoniczną.

Umieść tkanki w HBSS i odmierz około 10 mililitrów tkanki, analogicznie do poprzedniego etapu. Przenieś fragmenty tkanki, ograniczając do minimum transfer cieczy, do 10-centymetrowej szalki Petriego i posiekaj nożyczkami na drobne kawałki o objętości około jednego milimetra sześciennego. Przenieś posiekaną tkankę z powrotem do probówki 50 ml.

Powtórz procedurę dla wszystkich pozostałych próbek tkanek. Dodaj świeżo przygotowane medium do trawienia w stosunku co najmniej jeden do jednego w stosunku do tkanki. Kilkakrotnie odwróć probówkę, aby wymieszać zawartość.

Inkubować tkanki w probówce z pożywką do trawienia przez jedną do dwóch godzin w temperaturze 37°C w inkubatorze wytrząsowym. Gdy roztwór do trawienia tkanek stanie się mętny, a w roztworze pojawią się wyraźne białe naczynia krwionośne, dodać 15 ml HBSS, aby rozcieńczyć enzymy w pożywce do trawienia. Próbki poddać krótkiemu wirowaniu pulsacyjnemu tylko do momentu osiągnięcia przez wirówkę 340 g przez pięć sekund, a następnie zatrzymać urządzenie.

Dzięki temu duże zanieczyszczenia zbiorą się na dnie probówki. Przenieś próbki z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego. Umieść sitko do oddzielania komórek w nowej probówce o pojemności 50 ml.

Przenieś pipetą supernatant zawierający komórki mononuklearne do sita, zbierając eluat do nowej probówki. Pozostaw pozostałości tkanki łożyska w pierwszej probówce. Dodaj 15 milliliters HBSS do pozostałości łożyska, energicznie wstrząśnij w celu odzyskania większej liczby komórek, a następnie poddaj próbkę krótkotrwałemu wirowaniu pulsacyjnemu.

Ponownie przenieś nadaninę za pomocą pipety do probówki z sitkiem do komórek umieszczonym w probówce zbiorczej. W zależności od konsystencji próbki, bardziej odpowiednie może być przelanie nadaniny przez sitko. Przemyj sitko 5 mililitrami HBSS.

Wyrzuć probówkę zawierającą resztki tkanki łożyskowej. Odwiruj próbkę supernatantu przez pięć minut przy 340 g, aby utworzyć pellet komórkowy. Erytrocyty są widoczne jako warstwa na dnie pelletu, a komórki mononuklearne, w tym MSC, stanowią jaśniejszą warstwę nad erytrocytami.

Przenieś próbki z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego. Ostrożnie odlej nadsącz i go usuń. Kilka razy uderz palcem w ściankę probówki, aby odczepić pellet komórkowy, a następnie resuspenduj pellet w 35 mililitrach pożywki MSC.

Przenieś zawiesinę komórkową do jednej kolby T175 na każde 10 mil tkanki i hoduj w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2. Po izolacji wymień podłoże hodowalne po 48 godzinach. Dokarmiaj hodowle raz w tygodniu aż do osiągnięcia konfluencji.

Kultury powinny osiągnąć konfluencję w ciągu około 14 dni. Na koniec należy namnożyć i kriokonserwować komórki, przeanalizować charakterystykę MSC oraz wykorzystać je w eksperymentach. Po 48 godzinach hodowli komórki MSC przyłączą się do plastiku do hodowli tkankowej, natomiast komórki hematopoetyczne i inne populacje komórek nie zrobią tego.

W tym momencie pożywkę wymienia się na 35 ml świeżej pożywki hodowlanej. Wygląd supernatantu hodowli może znacznie różnić się w zależności od dawcy łożyska. Przykład pierwszy i drugi demonstrują tę zmienność.

Te dwie izolacje przeprowadzono jednocześnie, lecz z dwóch różnych łożysk. Po przemyciu kultury są wolne od erytrocytów i szczątków tkankowych, co pokazano w przykładzie trzecim, a późniejsze wyniki ekspansji są zazwyczaj spójne. Po wymianie medium po 48 godzinach do kolby przytwierdzone są tylko nieliczne komórki.

Siedem dni po izolacji widoczne są kolonie fibroblastycznych MSC, choć obecne są również komórki niebędące MSC, występujące jako komórki okrągłe lub słabo przylegające. 13 dni po izolacji kolonie fibroblastycznych MSC są duże, a warstwa MSC często osiąga wystarczającą konfluencję i jest gotowa do pasażowania. Od pierwszego pasażu i w kolejnych, warstwa MSC przy osiągnięciu konfluencji wykazuje charakterystyczną morfologię przypominającą wiry.

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) z łożyska wykazują klasyczny profil markerów MSC w analizie przepływowej. Komórki są dodatnie w kierunku CD73, CD105 i CD90 oraz ujemne w kierunku markerów hematopoetycznych CD45, CD34 i HLA-DR. MSC z łożyska zazwyczaj ulegają intensywnemu różnicowaniu osteogenicznemu, lecz słabemu różnicowaniu adipogenicznemu.

Wiele publikacji zakłada, że komórki wyizolowane z błony owodniowego chorionu po hodowli dają MSC płodu. Jednakże, jak raportowaliśmy wcześniej, wszystkie hodowle pochodne z chorionu płodu uzyskane za pomocą tego protokołu szybko ulegają wzbogaceniu w macierzyste MSC matki, co jest spodziewane w przypadku hodowli MSC z macierzystej błony deciduum. Przedstawione tutaj dane ilościowo określają skład komórek płodowych i macierzyńskich w hodowlach MSC łożyska wyizolowanych z tkanek deciduum, kosmków błoniastych oraz blaszki bliźniączkowej chorionu.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dość dobre pojęcie o tym, jak izolować i hodować MSC pochodzące z tkanki łożyskowej. Mamy nadzieję, że metody te okażą się przydatne w Państwa badaniach oraz zastosowaniach klinicznych, w których wykorzystywane są MSC pochodzące z łożyska.