Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym: funkcjonalny biomarker do oceny niekorzystnych skutków toksyn i toksyn oraz korzyści zdrowotnych produktów naturalnych
25 grudnia 2016
Ten protokół opisuje technikę przenoszenia barwnika metodą skalpela i fluorescencyjnego, która mierzy komunikację międzykomórkową poprzez kanały połączeń szczelinowych. Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym jest głównym procesem komórkowym, w którym utrzymywana jest homeostaza tkanek, a zakłócenie tej sygnalizacji komórkowej ma niekorzystne skutki zdrowotne.
Ogólnym celem jest dostarczenie prostego testu do pomiaru komunikacji międzykomórkowej w szczelinie za pośrednictwem populacji komórek ssaków, który może zaspokoić szeroki zakres potrzeb farmakologicznych i toksykologicznych in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie toksykologii, takie jak to, czy związek wpływa na rozwój lub utrzymanie tkanki, poprzez rozregulowanie komunikacji międzykomórkowej w szczelinie. Główną zaletą tej techniki jest to, że oferuje prostą i szybką ocenę funkcji złącza szczelinowego w dużej populacji komórek w odpowiedzi na toksyny i toksyny.
Procedurę zademonstruje Ajna Uzuni, asystentka naukowa z mojego laboratorium. Aby rozpocząć eksperyment, wysiewaj trzy razy 10 do piątej WB-F344 komórek nabłonka wątroby szczura na płytkach hodowlanych o średnicy 35 milimetrów zawierających zmodyfikowaną pożywkę Eagle'a oraz 5% płodowej surowicy bydlęcej. Hoduj komórki w inkubatorze, aż osiągną 100% zbieżności i kontynuuj eksperymentalne traktowanie komórek.
Aby kontynuować eksperymenty dawka-odpowiedź, dodaj 10 mikrolitrów i 20 mikrolitrów wcześniej przygotowanego, dwumilimolowego roztworu podstawowego fenantrenu w 100% acetonitrylu oraz cztery mikrolitry, sześć mikrolitrów i osiem mikrolitrów 20-milimolowego roztworu podstawowego fenantrenu w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórek zawierających dwa mililitry pożywki wzrostowej na każdą dodaną objętość roztworu podstawowego. Następnie dodaj cztery mikrolitry, sześć mikrolitrów, osiem mikrolitrów, 10 mikrolitrów i 20 mikrolitrów 100% roztworu acetonitrylu do trzech płytek komórek zawierających dwa mililitry pożywki wzrostowej na każdą dodaną objętość roztworu acetonitrylu, który ma służyć jako kontrola nośnika. Po dodaniu acetonitrylu inkubować płytki.
Aby przeprowadzić eksperymenty z reakcją czasową, dodaj siedem mikrolitrów 20-milimolowego roztworu podstawowego fenantrenu w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórek, zawierających dwa mililitry pożywki wzrostowej na każdy punkt czasowy. Następnie dodaj siedem mikrolitrów 100% acetonitrylu do trzech płytek komórek, zawierających dwa mililitry pożywki wzrostowej na każdy punkt czasowy, aby służyły jako kontrola nośnika. Inkubuj płytki dla każdego wyznaczonego punktu czasowego.
Wyrzuć pożywkę hodowlaną, delikatnie odlewając pożywkę. Przepłucz komórki trzema mililitrami PBS i albo zdekantuj, albo odessaj między płukaniami. Odpipetować jeden mililitr jednego miligrama na mililitr żółtego barwnika lucyfera rozpuszczonego w PBS do każdej płytki komórkowej.
Wstępnie załaduj barwnik do komórek, ściskając skalpel między palcem wskazującym a kciukiem. Umieść skalpel prostopadle do krawędzi płytki hodowlanej i pięć milimetrów od niej, a następnie użyj grawitacji, aby skalpel delikatnie przetoczył się z tego prostopadłego kąta pod kątem 15 stopni. Przetocz ostrze przez populację komórek w trzech różnych obszarach całej płytki.
Następnie inkubuj komórki z roztworem LY przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Zdekantować lub odessać LY i przepłukać komórki, aby usunąć cały barwnik zewnątrzkomórkowy i wyeliminować zewnątrzkomórkową fluorescencję tła. Następnie dodaj 0,5 mililitra 4% roztworu formaliny buforowanej fosforanem, aby utrwalić komórki.
Zobacz utrwalone komórki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przy 200-krotnym powiększeniu. Wyrównaj wszystkie płytki tak, aby linia wcięcia była równoległa do poziomego pola widzenia. Wygenerowano serię obrazów SL-DT komórek nabłonka wątroby szczura WB-F344 leczonych rosnącymi dawkami fenantrenu.
Spadek migracji żółtego barwnika fluorescencyjnego lucyfera jest spowodowany rosnącymi dawkami fenantrenu, co świadczy o rosnącym indukowanym przez toksyny hamowaniu komunikacji międzykomórkowej w szczelinie lub GJIC. Ułamek kontrolny lub wartości FOC uzyskane z obrazów SL-DT uśredniono, przeanalizowano statystycznie, a następnie sporządzono wykres. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak western blot pojedynczych białek transdukcji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania.
Na przykład, czy te związki aktywują mitogenne zdarzenia perforacji komórek?
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje technikę przeniesienia barwnika fluorescencyjnego metodą ładowania skalpelem, która służy do pomiaru komunikacji międzykomórkowej poprzez kanały połączeń szczelinowych. Metoda ta stanowi prosty test pozwalający ocenić międzykomórkową komunikację szczelinową w komórkach ssaków, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia homeostazy tkankowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Toksykologia
Wstęp
- Międzykomórkowa komunikacja poprzez połączenia szczelinowe jest niezbędna do utrzymania homeostazy tkankowej.
- Zaburzenie tej komunikacji może prowadzić do negatywnych skutków zdrowotnych.
- Technika ta pozwala na szybką ocenę funkcji połączeń szczelinowych.
- Można ją zastosować w różnych badaniach farmakologicznych i toksykologicznych.
Cel badania
- Pomiar wpływu związków na międzykomórkową komunikację poprzez połączenia szczelinowe.
- Zapewnienie niezawodnej metody oceny rozwoju i utrzymania tkanek.
- Ułatwienie badań toksykologicznych dotyczących wpływu toksyn na komunikację komórkową.
Zastosowane metody
- Wysiać komórki nabłonka wątroby szczura WB-F344 na płytki hodowlane.
- Hodować komórki do momentu osiągnięcia 100% konfluencji.
- Poddać komórki działaniu czynników eksperymentalnych.
- Wykorzystać transfer barwnika fluorescencyjnego w celu oceny komunikacji międzykomórkowej.
Główne wyniki
- Technika ta umożliwia ocenę funkcji złączy szczelinowych w dużych populacjach komórek.
- Pozwala ona na zrozumienie, w jaki sposób substancje toksyczne wpływają na komunikację międzykomórkową.
- Wykazano jej skuteczność w różnorodnych badaniach in vitro.
- Szybki i prosty protokół zwiększa efektywność badań.
Wnioski
- Metoda ta jest cennym narzędziem w badaniach toksykologicznych.
- Pomaga ona w zrozumieniu roli złączy szczelinowych w zdrowiu tkanek.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć zakres jej zastosowań w farmakologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Międzykomórkowa komunikacja przez złącza szczelinowe (GJIC) służy jako funkcjonalny biomarker do oceny zaburzeń homeostazy tkankowej wywołanych przez toksykanty oraz do ewaluacji efektów ochronnych produktów naturalnych. Technika transferu barwnika fluorescencyjnego z obciążeniem skalpelem (SL-DT) umożliwia szybką ocenę inhibicji GJIC na poziomie populacji, wspierając analizę ryzyka mechanistycznego we wczesnych etapach odkrywania leków. Test ten zapewnia pewność prognostyczną w priorytetyzacji związków na podstawie ich wpływu na szlaki komunikacji komórkowej krytyczne dla funkcji narządów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez powiązanie ekspozycji na związek chemiczny z zaburzeniem GJIC jako mechanizmem toksyczności.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośredni pomiar aktywności kanałów międzykomórkowych w populacjach żywych komórek.
- Wartość prognostyczna: Wspomaga selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację wczesnych biomarkerów działań niepożądanych wpływających na utrzymanie i homeostazę tkanek.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez ustalenie bazowej zdolności do GJIC.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe odczyty transferu barwnika, które można zautomatyzować i poddać wysokoprzepustowemu obrazowaniu.
- Skalowalność: Metoda dostosowana do skrawków tkanek in vivo i możliwa do zastosowania w zautomatyzowanej mikroskopii fluorescencyjnej w celu zwiększenia przepustowości próbek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki badań podstawowych z walidacją przedkliniczną poprzez konserwatywne mechanizmy GJIC u różnych gatunków.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pozwala ustalić, czy obserwowane fenotypy wynikają z zaburzeń komunikacji międzykomórkowej, a nie z efektów pozatarczeowych.
- Decyzje z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera kryteria postępu badań poprzez kwantyfikację zależności struktura-aktywność w modulacji GJIC.
Integracja potoku i przepływu pracy
Test SL-DT służy jako narzędzie na etapie odkrywania w celu uzyskania wglądu w mechanizmy działania, stosowane przed optymalizacją wiodących związków do odfiltrowania tych, które wiążą się z wysokim ryzykiem uszkodzenia tkanek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez ilościowe określanie, w jaki sposób toksykanty lub produkty naturalne zmieniają sieci sygnalizacji międzykomórkowej.
- Przesiewy (Screening): Zapewnia gotowość do przeprowadzania analiz dzięki powtarzalnym, populacyjnym odczytom funkcjonalnym odzwierciedlającym komunikację na poziomie tkankowym.
- Analityka: Generuje wartości ułamka kontroli (FOC), umożliwiając porównanie statystyczne pomiędzy różnymi dawkami i punktami czasowymi.
- Badania translacyjne: Wspiera strategie poszukiwania biomarkerów poprzez powiązanie funkcji GJIC z wynikami dotyczącymi integralności tkanek w modelach przedklinicznych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Służy jako uniwersalna platforma wykorzystywana w programach rozwoju toksykologii, farmakologii oraz nutraceutyków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną, zapewniając bezpośredni odczyt funkcjonalny aktywności kanałów połączeń szczelinowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki prostemu ładowaniu skalpelem oraz obrazowaniu z ustalonym punktem końcowym.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie wczesnego zaburzenia GJIC z późniejszymi niekorzystnymi efektami tkankowymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację z uwzględnieniem ryzyka poprzez identyfikację związków, które zachowują homeostazę komunikacji międzykomórkowej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórkowej, pracy z barwnikami fluorescencyjnymi oraz w mikroskopii epifluorescencyjnej.
- Zależy od ustandaryzowanej techniki użycia skalpela oraz powtarzalnego czasu inkubacji w celu zapewnienia wiarygodnego przeniesienia barwnika.
- Wymaga uzgodnienia między zespołami progów analizy obrazu oraz parametrów morfometrycznych.
- Możliwość adaptacji dla różnych typów komórek ssaków i przekrojów tkankowych po optymalizacji parametrów obciążenia i fiksacji.
- Ograniczona do oceny funkcjonalnej aktywności kanałów; nie pozwala na rozróżnienie między ekspresją koneksyn, ich fosforylacją a stanami bramkowania.
