Wysokoprzepustowe znakowanie genów u Trypanosoma brucei

Ogólnym celem tej metody jest wysokoprzepustowe znakowanie białek w Trypansoma brucei. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie kinetoplastid dotyczące lokalizacji i potencjalnej funkcji dużych grup białek. Główną zaletą tej techniki jest możliwość szybkiego i łatwego równoległego znakowania znacznej liczby białek.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat lokalizacji, oddziaływania dużych grup białek można badać również przy użyciu innych znaczników. Przykładem jest znacznik BirA stosowany w eksperymentach mapowania bliskości Bio-ID. Procedurę zaprezentuje Ross Madden, asystent badawczy z naszego laboratorium.

Przed rozpoczęciem tej procedury należy uprzednio zamrozić blok chłodzący do PCR z 96 dołkami w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Przygotuj Master Mix A, łącząc w probówce o pojemności 10 ml następujące składniki: 100 µL destylowanej wody dejonizowanej, 105 µL DMSO klasy PCR, 105 µL 10 mM dNTPs oraz 105 µL matrycy pPOT.

Nalej Master Mix A do zbiornika na odczynniki i odmierz 23 µL Master Mix A do każdej studni płytki PCR z 96 studniami. Używając 12-kanałowej pipety wielokanałowej P20, dodaj 2 µL połączonych starterów o stężeniu 100 µM do każdej wypełnionej studni. Uszczelnij płytkę folią.

Umieść go w schłodzonym chłodniku do PCR i pozostaw do zamrożenia na minimum 20 minut w temperaturze -80°C. Zamrożenie PCR Master Mix A jest kluczowe dla zapewnienia wydajnej reakcji hot start, nawet przy zastosowaniu specyficznej polimerazy hot start. Pozwala to na uzyskanie powtarzalnej amplifikacji o wysokiej wydajności.

Podczas gdy płytka PCR znajduje się w zamrażarce, przygotuj Master Mix B. Połącz następujące składniki w probówce o pojemności 10 ml: 2 048 µL wody destylowanej i dejonizowanej, 525 µL buforu 10X oraz 52,5 µL polimerazy, aby uzyskać całkowitą objętość 2 626 µL na płytkę. Wyjmij płytkę PCR oraz chłodniczkę do PCR z zamrażarki o temperaturze -80 °C.

Gdy płytka wciąż znajduje się w chłodnice do PCR, szybko dodaj 25 µl Master Mix B na zamrożony Master Mix A w każdej studzience, tak aby całkowita objętość reakcji wynosiła 50 µL. Jest to krok krytyczny czasowo i musi zostać wykonany przed rozmrożeniem Master Mix A. Uszczelnij płytkę folią.

Ustaw parametry termocyklera w następujący sposób: 94 °C przez 10 minut, następnie 30 cykli obejmujących 94 °C przez 15 sekund, 65 °C przez 30 sekund i 72 °C przez dwie minuty, a na koniec etap końcowej elongacji w temperaturze 72 °C przez siedem minut. Po osiągnięciu przez blok temperatury 94 °C, umieść płytkę PCR w termocyklerze i uruchom program amplifikacji.

Procedurę należy rozpocząć od przygotowania dużego żelu agarozowego 1% w buforze do elektroforezy Tris-octan EDTA lub TAE, z czterema rzędami studzienek. Do pierwszej i 28. studzienki każdego rzędu należy nanieść marker DNA 1 kb. W następnym kroku należy przenieść dwa mikrolitry produktu PCR bezpośrednio, bez użycia buforu do nakładania DNA, do poszczególnych ścieżek żelu, zgodnie z przedstawionym tutaj schematem.

Na przykład produkty PCR z rzędów A i B płytki PCR nanosi się odpowiednio do nieparzystych i parzystych ścieżek pierwszego rzędu żelu. Pracując szybko, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia amplikonów, nanieś produkty PCR z rzędu A płytki PCR do nieparzystych ścieżek pierwszego rzędu żelu. Następnie nanieś produkty PCR z rzędu B płytki PCR do parzystych ścieżek pierwszego rzędu żelu.

Załaduj produkty PCR z rzędów C i D płytki PCR, stosując ten sam schemat: rząd C do nieparzystych ścieżek, a rząd D do parzystych ścieżek w drugim rzędzie żelu. Kontynuuj ładowanie według tego schematu, aż wszystkie studzienki z płytki PCR zostaną przeniesione na żel. Umieść żel w komorze elektroforetycznej i wypełnij ją buforem TAE do momentu całkowitego zanurzenia żelu.

Elektroforezę prowadzono przy napięciu 100 V przez 30 minut. Wizualizacji dokonano przy użyciu transiluminatora UV. Przedstawiono reprezentatywny żel agarozowy do walidacji PCR w 96-dołkowym formacie, w którym 95 z 96 reakcji PCR zakończyło się powodzeniem.

Nieudaną reakcją PCR była próbka H11. W tej procedurze wykorzystuje się linię komórkową SMOXP9 procyklicznej formy Trypanosoma brucei. Hoduj komórki do odpowiedniej gęstości, zgodnie z opisem w tekście protokołu, a następnie zbierz wymaganą liczbę komórek poprzez wirowanie przy 800 g przez 10 minut.

Rozpocznij przygotowania do elektroporacji podczas wirowania komórek. Podłącz manipulator do płytek do elektroporatora. W urządzeniu do elektroporacji ustaw napięcie na 1 500 V, czas trwania impulsu na 100 µs, liczbę impulsów na 12 oraz odstęp między impulsami na 500 ms.

W manipulatorze płytek ustaw liczbę impulsów na jeden. Używając 12-kanałowej pipety wielokanałowej P200, przenieś reakcje PCR z płytki PCR do jednorazowej płytki do elektroporacji z 96 dołkami. Przemyj komórki w 10 milliliters zmodyfikowanego cytomixu i ponownie odwiruj przy 800 ×g przez 10 minut.

Resuspender komórki w 23 mililitrach zmodyfikowanego cytomixu, aby uzyskać stężenie końcowe 5 × 10⁷ komórek na mililitr. Przenieść zawiesinę komórkową do zbiornika na odczynniki. Pipetować 200 µL roztworu komórek do każdej studni płytki do elektroporacji i wymieszać z produktem PCR za pomocą pipety.

Użyj chusteczki, aby usunąć wszelkie kropelki z górnej części płytki, aby uniknąć zwarć. Nałóż folię uszczelniającą na górną część płytki do elektroporacji, pozycjonując ją tak, aby otwory na elektrody na górze i na dole każdej kolumny pozostały odsłonięte. Unikaj zakrywania wypukłych punktów służących do prowadzenia folii.

Umieść płytkę do elektroporacji w manipulatorze płytek i zamknij pokrywę. Naciśnij przycisk „pulse” na urządzeniu do elektroporacji. Po elektroporacji komórki należy szybko przenieść do czterech 24-dołkowych płytek hodowlanych, w których każdy dołek zawiera 1 ml pożywki SDM-79 w celu rekonwalescencji.

Użyć 12-kanałowej pipety wielokanałowej P200 z pominięciem co drugiej końcówki, tak aby pozostałe sześć końcówek pokrywało się z sześcioma rzędami na 24-dołkowej płytce do hodowli tkanek. Po przeniesieniu komórek z płytki 96-dołkowej na płytkę 24-dołkową, przemyć dołki w płytce 96-dołkowej pożywką z odpowiadających im dołków w płytce 24-dołkowej. Następnie przenieść płuczkę z powrotem do dołków w płytce 24-dołkowej.

Przenieś elektroporowane komórki z 96-dołkowej płytki do elektroporacji do 24-dołkowych płytek do hodowli tkanek zgodnie z określonym wcześniej schematem przedstawionym tutaj. Na przykład komórki z nieparzystych dołków w rzędzie A płytki 96-dołkowej przenosi się do rzędu A płytki A, natomiast komórki z parzystych dołków w rzędzie A płytki 96-dołkowej przenosi się do rzędu A płytki C. Po każdym przeniesieniu komórek z płytki 96-dołkowej do płytki 24-dołkowej przemyj dołki w płytce 96-dołkowej pożywką z odpowiadającego rzędu płytki 24-dołkowej. Następnie przenieś płuczkę z powrotem do płytki 24-dołkowej.

Przenoszenie komórek do płytek 24-dołkowych może być mylące, jednak konieczne jest dokładne przypisanie uzyskanych linii komórkowych do odpowiedniego identyfikatora genu. Kluczowe jest szybkie wykonanie tego kroku, aby zachować żywotność komórek. Po przeniesieniu wszystkich elektroporowanych komórek do czterech płytek 24-dołkowych, należy umieścić płytki w czystym plastikowym pudełku z dopasowaną, szczelną pokrywą. Pudełko należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 28 °C.

Od sześciu do ośmiu godzin później do każdej studni należy dodać jeden mililitr SDM-79 z 10% FCS zawierającego antybiotyk selektywny. Inkubować w temperaturze 28°C przez od dziewięciu do 10 dni, aż linie komórkowe transgeniczne staną się widoczne. Po transfekcji w płytce 96-dołkowej w celu znakowania 96 różnych białek na terminie końcowym, komórki przenosi się do 24-dołkowych płytek hodowlanych w celu rekonwalescencji i selekcji.

Następnie oceniane są poszczególne studzienki w celu ustalenia, czy zawierają one zdrowe komórki oporne na lek. Zdrowa studzienka zawiera głównie wysoce aktywne komórki, które są jasne w mikroskopii kontrastowej. Na tym schemacie kolor zielony oznacza studzienkę z udaną transfekcją, a kolor szary oznacza studzienkę zawierającą wyłącznie martwe komórki.

88 z 96, czyli 92% studzienek, zawiera pomyślnie przetransfekowane pasożyty po 15 dniach selekcji. Po opanowaniu metody, czas od policzenia komórek do ich wysiania po elektroporacji wyniesie około godziny. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dodaniu leków selekcyjnych od sześciu do ośmiu godzin po transfekcji.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu znakowania dużych kohort białek u *Trypanosoma brucei*.