Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tej metody jest ilościowe określenie ekspresji białek błonowych na powierzchni komórki za pomocą fluorescencyjnego testu w odstępach. Główną zaletą tej techniki jest to, że testy cytometrii przepływowej dostarczają wymiernych punktów końcowych na dużych objętościach żywych komórek w jednym eksperymencie. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy i terapii arytmii komorowych serca, ponieważ patologie te są często związane z mutacjami genetycznymi, które powodują defekty w transporcie kanałów jonowych serca.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mają trudności ze znalezieniem odpowiedniego miejsca insercji zewnątrzgrzbietowej dla epitopu, które nie szkodzi funkcji białka i generuje silny sygnał fluorescencyjny w obecności sprzężonego przeciwciała. Tę procedurę zademonstruje Benoite Bourdin, asystentka naukowa z mojego laboratorium. Na początek podwójnie znakowane DNA konstruuje się z mCherry na wewnątrzkomórkowym C-końcu.

Ekspresja epitopu hemmaglutyniny skierowanego w stronę dodatkowej komórki, który można zmierzyć za pomocą przeciwciała fluorescencyjnego w celu oszacowania ekspresji białek błonowych na powierzchni komórki. Następnie hoduj płytkę komórek TSA201 przy użyciu standardowych technik, aż osiągną 90% konfluencji. Dla każdej próbki należy przygotować odczynniki do transfekcji w dwóch probówkach.

Przygotuj jedną 1,5-mililitrową probówkę z czterema mikrogramami DNA i 250 mikrolitrami zredukowanej pożywki surowicy oraz drugą probówkę z 10 mikrolitrami odczynnika do transfekcji za pośrednictwem liposomów i 250 mikrolitrów zredukowanej pożywki hodowlanej surowicy. Delikatnie wymieszaj dwie probówki i inkubuj je przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie delikatnie połącz zawartość probówki pierwszej i probówki drugiej i inkubuj kompleksy liposomowego DNA przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Dodaj kompleksy do hodowanych komórek i delikatnie kołysz szalką hodowlaną. Umieść naczynie z powrotem w temperaturze 37 stopni Celsjusza i w atmosferze 5% dwutlenku węgla na 24 godziny. 24 godziny po dodaniu odczynnika do transfekcji wyjąć pożywkę z naczynia hodowlanego i ostrożnie umyć komórki 400 mikrolitrami wstępnie podgrzanej trypsyny-EDTA.

Następnie dodaj 400 mikrolitrów Trypsyny-EDTA i inkubuj naczynie przez pięć minut, aby komórki odłączyły się od naczynia. Po odłączeniu zatrzymaj trawienie enzymu, dodając do komórek jeden mililitr zimnej pożywki hodowlanej bez penicyliny lub streptomycyny. Delikatnie odpipetuj pożywkę na płytce cztery do pięciu razy, aby zmyć wszystkie komórki z powierzchni.

Następnie zbierz komórki w sterylnych probówkach o pojemności 1,5 mililitra i natychmiast umieść je na lodzie. W kolejnych krokach użyj lodowatego roztworu i utrzymuj komórki w temperaturze czterech stopni, aby zapobiec internalizacji epitopu powierzchniowego. Zmniejsz również ekspozycję komórek na światło, aby ograniczyć fotowybielanie sygnału fluorescencyjnego.

Następnie odwiruj probówki, aby osadzać komórki. Następnie ostrożnie odessać i wyrzucić powstały supernatant. Ponownie zawiesić osad, aby przygotować zawiesinę jednokomórkową przy użyciu jednego mililitra PBS.

Następnie krótko odwirować probówki. Osadzać i ponownie zawiesić komórki w celu całkowitego usunięcia pożywki hodowlanej. Następnie ponownie zawieś osad komórek w 600 mikrolitrach PBS.

Zmierz stężenie komórek i dostosuj je do co najmniej trzech milionów komórek na mililitr. Następnie podziel komórki na nowe rurki o pojemności 1,5 mililitra. Należy pamiętać o dołączeniu odpowiednich kontrolek, aby odróżnić barwienie specyficzne od barwienia niespecyficznego oraz barwienie pozakomórkowe, a także barwienie wewnątrzkomórkowe.

Przeciwciało kontrolne izotopowe pomoże ocenić poziom zabarwienia tła i powinno być zgodne z przeciwciałem pierwszorzędowym, izotopem pomyślnym i fluoroforem. Ważne jest, aby stosować przeciwciało izotopowe kontrolne i przeciwciało fluorescencyjne w tym samym stężeniu. Aby oszacować ekspresję białek błonowych na powierzchni komórki, najpierw oznacz tylko epitop HA skierowany w stronę innej komórki za pomocą przeciwciała sprzężonego ze światłem fluorescencyjnym.

Następnie dodać do probówki monoklonalne przeciwciało anty-HA sprzężone z FITC w stężeniu pięciu mikrogramów na mililitr. Krótko zawiruj komórki, a następnie inkubuj je na platformie kołyskowej w ciemności. Usuń komórki z ciemności i dodaj 900 mikrolitrów PBS.

Następnie odwirować probówkę, aby osadzać komórki i odessać supernatant. Następnie umyj komórki, ponownie zawieszając granulkę w jednym mililitrze PBS i krótko wirując komórki. Następnie powtórz krok wirówki, aby ponownie zagnieździć komórki.

Powtórz ten etap płukania w sumie trzy razy, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała. Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach PBS i przenieś zawiesinę pojedynczej komórki do pięciomililitrowej rurki cytometrii przepływowej. Utrzymuj komórki w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż próbka zostanie uruchomiona.

Aby oszacować wewnątrzkomórkową ekspresję białka całkowitego, należy następnie oznaczyć przepuszczalne komórki. Osiąga się to przy użyciu podobnego protokołu do znakowania zewnątrzkomórkowego, ale z dodatkiem bufora przepuszczalności komórek na bazie saponin. Zwinąć komórki, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach roztworu przepuszczalnego do utrwalania bezpośrednio z przygotowanego wywaru.

Inkubuj komórki w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego buforu do płukania przepuszczalności i krótko zawiruj komórki. Następnie opelajuj komórki i umyj je jeszcze dwa razy za pomocą bufora do płukania permeabilizacji.

Następnie dodać sprzężone z FITC monoklonalne przeciwciało anty HA w stężeniu 5 mikrogramów na mililitr i 100 mikrolitrów buforu do przemywania permeabilizacji. Krótko zawiruj komórki i inkubuj komórki w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu do płukania przepuszczalności.

Osadzać komórki i myć je trzykrotnie w 100 mikrolitrach tego samego buforu, jak pokazano wcześniej. Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach PBS i przenieś zawiesinę pojedynczej komórki do pięciomililitrowej rurki cytometrii przepływowej. Tego samego dnia przepuść nieprzepuszczalne i przepuszczalne komórki przez cytometr przepływowy.

Aby rozpocząć, uruchom oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej i zaimportuj pliki fcs utworzone podczas cytometrii przepływowej. Kliknij pierwszą próbkę i rozpocznij proces bramkowania na wykresie rozproszenia bocznego i rozproszenia do przodu. Następnie narysuj bramkę P1 za pomocą ikony elipsy wokół żywych komórek, aby wyeliminować wszelkie zanieczyszczenia, martwe komórki lub agregaty.

Następnie narysuj wykres konturu parametru rurki mCherry w funkcji intensywności fluorescencji FITC. Ustaw bramkę P2 wokół komórek FITC i mCherry dodatnich, a bramkę P3 wokół populacji komórek ujemnych fluorescencyjnie. Następnie wybierz bramki P2 i P3 i kliknij ikonę dodawania statystyk w oryginalnym oknie obszaru roboczego.

Kliknij liczbę, a następnie kliknij średnią. Na koniec zastosuj parametry bramek i statystyki do wszystkich próbek badanych przez cytometr. Protokół ten wykorzystano do scharakteryzowania roli N-glikozylacji w całkowitej i powierzchniowej ekspresji CaV Alpha 2 Delta 1 w komórkach TSA201.

Aby uzyskać dostęp do powierzchni komórki, ekspresję białka HA mierzono na nieprzepuszczalnych komórkach, które miały zakłócone miejsca N-glikozylacji w czterech miejscach, 16 miejscach lub w żadnym miejscu. Poziomy FITC były silne w typie dzikim, a komórki z komórkami N-glikozylacyjnymi zostały zakłócone w czterech lokalizacjach, ale tylko poziomy tła stwierdzono w komórkach z 16 zakłóconymi lokalizacjami. W przypadku komórek przepuszczalnych fluorescencja FITC wzrosła we wszystkich warunkach, co wskazuje, że wszystkie transfekowane, znakowane HA białka CaV Alpha 2 Delta 1 zostały wybarwione i wykryte przez przeciwciało anty HA FITC.

Ponadto poziomy fluorescencji mCherry były podobne dla komórek przepuszczalnych i nieprzepuszczalnych, co oznacza, że przepuszczalność nie zmienia względnego sygnału mCherry. Testy przeprowadzone po przenikaniu komórek wykazały, że całkowita ekspresja białka dla komórek z zakłóconymi 16 lokalizacjami była również znacznie zmniejszona, niezależnie od tego, czy wywnioskowano ją z fluorescencji FITC w komórkach przepuszczalnych, czy z konstytutywnej fluorescencji mCherry mierzonej w komórkach nieprzepuszczalnych i przepuszczalnych. Oprócz tej procedury można wykonać dodatkowe zapisy fizjologiczne w celu skorelowania ekspresji i funkcji kanałów jonowych.

Technika ta toruje również drogę naukowcom z dziedziny medycyny do badania wpływu mutacji genetycznych, modyfikacji potranslacyjnych, mikroRNA, małych GTPaz i roli białek opiekuńczych w transporcie białek błonowych ulegających ekspresji w komórkach rekombinowanych lub natywnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić transfekcję DNA w komórkach rekombinowanych, barwieć NTAC i komórki przepuszczalne, a także przeprowadzać analizę danych na próbkach. Nie zapominaj, że praca z żywymi komórkami wymaga środków ostrożności, takich jak praca w płynie helaminalnym do transfiksacji i noszenie rękawiczek podczas pracy z chemikaliami.