Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni

Ogólnym celem tego testu jest wykrycie interakcji białko-DNA za pomocą sond nieradioaktywnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii molekularnej i biochemii, takie jak określenie docelowej sekwencji DNA białek. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to łatwa, bezpieczna i oszczędzająca czas alternatywa dla stosowania sond radioaktywnych.

Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj pięcioprocentowy natywny żel poliakrylamidowy zawierający 0,5x tris boran EDTA lub TBE i 2,5% glicerolu za pomocą systemu mini żelu białkowego. Aby przygotować 30 mililitrów roztworu żelu na cztery żele, wymieszaj wodę destylowaną, KZM, nadsiarczan amonu, TEMED, bis akryloamidu i glicerol. Natychmiast przepuścić roztwór żelu.

Po polimeryzacji zawiń żele w przezroczystą folię spożywczą wstępnie zwilżoną 0,5x TBE i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zaprojektuj długi oligonukleotyd na około 51 merów. Zaprojektuj komplementarne krótkie oligonukleotydy dla około 14 merów z modyfikacją barwnika fluorescencyjnego w podczerwieni na pięciu głównych końcach.

Po przygotowaniu oligonukleotydów należy je ponownie zawiesić w buforze 1x Tris-EDTA do końcowego stężenia 100 mikromolowych. Do wyżarzania wymieszaj 0,6 mikrolitra krótkiego oligonukleotydu z pięcioma głównymi barwnikami, 1,2 mikrolitra długiego oligonukleotydu i 28,2 mikrolitra buforu Tris-EDTA chlorku sodu w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Umieść probówkę we wrzącej wodzie na pięć minut, a następnie wyłącz źródło ciepła i pozwól wodzie z wyżarzonymi oligonukleotydami ostygnąć przez noc w ciemności.

Aby wykonać dwuniciowe sondy DNA, wymieszaj 30 mikrolitrów wyżarzonych oligonukleotydów z DNTP, buforem Klenowa, pięcioma głównymi znacznikami barwnika Klenowa i podwójnie destylowaną wodą w 0,2 mililitrowej probówce do PCR. Inkubować mieszaninę przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w maszynie do PCR. Następnie dodaj 3,4 mikrolitra 0,5 molowego EDTA, aby zatrzymać reakcję i podgrzej w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez 20 minut w maszynie do PCR.

Następnie rozcieńczyć wypełnione sondy buforem Tris-EDTA chlorku sodu do końcowego stężenia 0,1 mikromola. Oligonukleotydy należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w ciemności, aż będą gotowe do użycia. Aby przygotować nieznakowane sondy, wymieszaj 20 mikrolitrów długiego oligonukleotydu, 20 mikrolitrów oligonukleotydu Long R i 60 mikrolitrów buforu Tris-EDTA chlorku sodu w 1,5 mililitrowej probówce.

Umieść probówkę we wrzącej wodzie na pięć minut, a następnie wyłącz źródło ciepła i pozwól wodzie z wyżarzonymi oligonukleotydami ostygnąć przez noc. Przygotuj jeden mililitr 5x buforu wiążącego, mieszając Tris HCl, chlorek sodu, chlorek potasu, chlorek magnezu, EDTA, DTT, BSA i podwójnie destylowaną wodę. Przed rozpoczęciem reakcji wiązania należy wstępnie uruchomić 5% natywny żel poliakryloamidowy w 0,5x TBE i 2,5% glicerolu, aby usunąć wszelkie ślady nadsiarczanu amonu przy napięciu 80 woltów przez 30 minut do jednej godziny lub do momentu, gdy prąd przestanie się zmieniać w czasie.

Następnie wymieszaj cztery mikrolitry 5-krotnego buforu wiążącego, 80 do 200 nanogramów oczyszczonego białka A, jeden mikrolitr 0,1 mikromolowej sondy sprzężonej z barwnikiem i podwójnie destylowaną wodę. Inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej w ciemności przez 15 minut. Po inkubacji załaduj całą reakcję wiązania na żel i uruchom żel pod napięciem 10 woltów na centymetr na żądaną odległość.

Przykryj aparat żelowy aluminium, aby żel był jak najbardziej w ciemności. Wyczyść łóżko skanera systemu obrazowania w podczerwieni wodą destylowaną. Wytrzyj do sucha szklane płytki zawierające żel i umieść je na łóżku skanera.

Otwórz oprogramowanie do obrazowania w podczerwieni i kliknij kartę Pobierz. W przypadku grubszych płyt użyj ustawień 700 dla kanału, auto dla intensywności, 84 mikrometrów dla rozdzielczości, średniej dla jakości i 3,5 milimetra dla przesunięcia ostrości. Wybierz obszar, który żel zajmuje na skanerze.

Na koniec kliknij Start, aby rozpocząć skanowanie. Postęp elektroforezy można wizualizować za pomocą barwnika Orange G, podczas gdy błękit bromofenolowy jest wykrywany podczas skanowania i dlatego zakłóca analizę obrazu. Dodanie dI-dC do reakcji wiązania zniosło wiązanie oczyszczonego 6xHis-SOX-2 z pięcioma sondami DNA z głównym barwnikiem.

Mutant LIM-4 i zimna sonda SOX-2 zmutowane w miejscu wiązania LIM-4 są tak samo skuteczne jak zimna sonda typu dzikiego w konkurowaniu z sondą znakowaną barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni o wiązanie z 6xHis-SOX-2. Jednak skuteczność konkurencyjna zmutowanej zimnej sondy LIM-4 i SOX-2 zmutowanej w miejscu wiązania SOX-2 jest znacznie niższa niż zimnej sondy typu dzikiego w wiązaniu z 6xHis-SOX-2. Testy superprzesunięcia kompleksu DNA SOX-2 przy użyciu epitopów 6xHis i flagi dały w wyniku superprzesuniętego pasma DNA SOX-2.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do czterech godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby trzymać sondy podczerwieni w ciemności. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak edycja genomu CRISPR cas9, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak znaczenie określonej sekwencji wiążącej DNA.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biochemią do badania interakcji białko-DNA w różnych organizmach modelowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić interakcje białko-DNA za pomocą nieradioaktywnych etykiet DNA. Nie zapominaj, że praca z akrylamidem może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej.