Wykrywanie stabilnych aberracji międzychromosomowych za pomocą wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) u napromieniowanych myszy

Ogólnym celem tej molekularnej metody cytogennej jest obserwacja stabilnych aberracji międzychromosomowych w komórkach szpiku kostnego myszy wystawionych na napromienianie całego ciała. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie biologii radiacyjnej, takie jak ryzyko wywołania stabilnych aberracji chromosomowych w komórkach szpiku kostnego myszy narażonych na promieniowanie całego ciała. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona sterowaną wizualizację stabilnych uszkodzeń genetycznych wywołanych promieniowaniem w komórkach szpiku kostnego myszy, które mogą być rozmnażane przez wiele generacji komórek.

Po wyizolowaniu szpiku kostnego z kości udowej i piszczelowej myszy i wykonaniu zawiesiny pojedynczej komórki zgodnie z protokołem tekstowym, ostrożnie nałóż zawiesinę komórkową na równą objętość pożywki do separacji komórek jednojądrzastych szpiku kostnego. Odwirować gradient pod ciśnieniem 400 razy G w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie ostrożnie zbierz kożuchową powłokę, nie naruszając pozostałych warstw i przenieś roztwór do nowej 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Aby przygotować rozprzestrzenianie się komórek metafazy, dodaj 10 mililitrów PBS do probówki zawierającej kożuch. Następnie odwirować probówkę o sile 400 razy G w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie ostrożnie usuń supernatant i delikatnie postukaj w probówkę, aby rozbić osad komórkowy.

Następnie dodaj 10 mililitrów PBS i ponownie odwiruj zawiesinę. Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Rozbij osad i dodaj kropla po kropli cztery mililitry wstępnie podgrzanego hipotonicznego 0,075 molowego roztworu chlorku potasu, delikatnie i stale wstrząsając.

Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut w łaźni wodnej. Następnie dodaj równą objętość utrwalacza do probówki i delikatnie wymieszaj, odwracając probówkę. Odwirować probówkę i usunąć supernatant.

Następnie rozbij osad komórkowy i dodaj świeży utrwalacz. Powtórz wirowanie i dodawanie utrwalacza jeszcze pięć razy. Po ponownym wymieszaniu komórek w 400 do 600 mikrolitrach utrwalacza, upuść 30 mikrolitrów stałych komórek na wstępnie oczyszczone i mokre szkiełka przechylone pod kątem 45 stopni i pozostaw szkiełka do całkowitego wyschnięcia na powietrzu przez noc.

Aby przeprowadzić malowanie chromosomów myszy za pomocą mFISH, umieść szkiełko zawierające rozprzestrzenianie się komórek metafazowych w 2X SSC na dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie odwadniaj szkiełko przez seryjne płukanie etanolem w 70%80% i 100% etanolem przez dwie minuty w każdym praniu. Podgrzej 40 mililitrów roztworu denaturacyjnego w szklanym słoiku coplin do 70 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie przenieś szkiełko do podgrzanego roztworu i inkubuj próbkę przez jedną do 1 1/2 minuty w celu denaturacji chromosomów. Natychmiast użyj lodowatego 70% etanolu do wygaszenia szkiełka przez dwie minuty, aby zatrzymać proces denaturacji i zapobiec ponownemu wyżarzaniu zdenaturowanych chromosomów. Następnie odwodnić szkiełko za pomocą serii etanolu, zaczynając od 80% etanolu przez dwie minuty.

Następnie umieść szkiełko w 100% etanolu na dwie minuty. Następnie całkowicie wysusz szkiełko w temperaturze pokojowej. Aby zdenaturować sondę, należy na krótko odwirować mieszaninę sondy dostarczoną przez producenta, a następnie przenieść 10 mikrolitrów do probówki wirówkowej o pojemności 500 mikrolitrów i inkubować probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez siedem minut.

Teraz umieść probówkę zawierającą denaturowaną sondę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut. Następnie nałóż mieszaninę sondy na szkiełko ze zdenaturowanymi chromosomami. Ostrożnie przykryj obszar szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 milimetrów na 18 milimetrów i wyeliminuj wszelkie widoczne pęcherzyki powietrza, bardzo delikatnie dociskając szkiełko nakrywkowe do szkiełka.

Użyj cementu gumowego, aby uszczelnić wszystkie cztery strony szkiełka nakrywkowego. I inkubuj szkiełko w ciemności w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 16 godzin. Po hybrydyzacji ostrożnie usuń cement kauczukowy i szkiełko nakrywkowe, a następnie umieść szkiełko we wstępnie podgrzanym 0,4X SSC w temperaturze 74 stopni Celsjusza na pięć minut.

Następnie przenieś szkiełko do roztworu myjącego trzy na dwie minuty. Na szkiełko nanieść 20 mikrolitrów podłoża montażowego zapobiegającego blaknięciu z barwnikiem DAPI i przykryć szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Użyj bibułki laboratoryjnej, aby delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkowe, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza i nadmiar roztworu montażowego.

Następnie użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego. Obejrzyj preparaty za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w odpowiednie filtry. W celu kariotypowania spektralnego chromosomów myszy, po hybrydyzacji sond ze zdenaturowanymi chromosomami i umyciu próbek zgodnie z protokołem tekstowym, nałóż 80 mikrolitrów odczynnika do barwienia SY5 na szkiełko.

Umieść plastikowe szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 na 60 milimetrów na wierzchu próbki i inkubuj je w ciemności w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut. Zanurz szkiełko w szklanym słoiku z kopinem zawierającym podgrzany roztwór myjący trzy i inkubuj w łaźni wodnej w temperaturze 45 stopni Celsjusza, wstrząsając przez dwie minuty. Powtórz pranie trzy razy.

Nałóż 80 mikrolitrów odczynnika barwiącego SY5,5 na próbkę, przykryj ją plastikowym szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 na 60 milimetrów i inkubuj w ciemności w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut. Użyj podgrzanego roztworu myjącego, aby trzykrotnie umyć szkiełko, a następnie przytrzymaj szkiełko w pozycji pochylonej przy ręczniku papierowym, aby spuścić nadmiar płynu. Dodaj 20 mikrolitrów odczynnika DAPI zapobiegającego blaknięciu do próbki i ostrożnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu, nie wprowadzając żadnych pęcherzyków powietrza.

Użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie i obserwuj próbkę za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w aparaturę do robienia zdjęć nieba. Ten rysunek przedstawia reprezentatywne rozprzestrzenianie się komórek metafazy z normalnymi i nieprawidłowymi parami chromosomów myszy jeden, dwa i trzy. Oto stabilna aberracja obejmująca chromosom pierwszy, w której część chromosomu pierwszego została zintegrowana z niepomalowanym chromosomem DAPI, podczas gdy inna część utworzyła fragment acentryczny.

W tym przykładzie część chromosomu drugiego została zintegrowana z chromosomem niepomalowanym. Ta stabilna aberracja dotyczy chromosomu trzeciego. W tym rozprzestrzenianiu się metafazy obserwuje się stabilne aberracje obejmujące wszystkie trzy pomalowane chromosomy.

Pokazany tutaj jest przykład kariotypowania spektrologicznego normalnej samicy myszy. Panel ten reprezentuje stabilną aberrację obejmującą chromosomy 4 i 12. Wreszcie, stabilna aberracja chromosomowa w tym panelu obejmuje chromosom siódmy i 10.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 48 do 72 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że należy używać tylko komórek proliferujących. Postępując zgodnie z tą procedurą i innymi metodami, takimi jak w paśmie, można użyć do odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy w napromienianych komórkach występują stabilne aberracje międzychromosomowe.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się cytogenetyką molekularną do zbadania związku między aberracjami genetycznymi a różnymi chorobami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć jaśniejsze pojęcie, jak określić stabilne aberracje międzychromosomowe. Nie zapominaj, że praca z kolchicyną może być niezwykle niebezpieczna, ponieważ jest ona rakotwórcza i podczas wykonywania tego eksperymentu należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.