Ostre i przewlekłe modele hiperglikemii u danio pręgowanego: metoda oceny wpływu hiperglikemii na neurogenezę i biodystrybucję cząsteczek znakowanych radioaktywnie

Ogólnym celem poniższej procedury jest ocena przebudowy mózgu w warunkach hiperglikemii oraz śledzenie cząsteczek znakowanych izotopowo u rybek danio pręgowanych. Hiperglikemia charakteryzuje się nadmiernym stężeniem glukozy we krwi. Przewlekła hiperglikemia może wynikać ze stanów cukrzycowych i powodować różne dysfunkcje naczyniowe, które z kolei mogą wywołać powikłania kliniczne, takie jak zawał mięśnia sercowego, udar lub stopa cukrzycowa.

Ponadto ostra hiperglikemia wywołana stresem może sprzyjać powikłaniom krwotocznym w udarze niedokrwiennym. Danio pręgowany jest interesującym modelem do badania chorób ludzkich oraz ich wpływu na ośrodkowy układ nerwowy. Jest to szczególnie istotne, biorąc pod uwagę, że mózg dorosłych ryb wykazuje intensywną zdolność neurogenną oraz wyjątkowe możliwości w zakresie mechanizmów naprawczych mózgu w porównaniu do ssaków; w związku z tym danio pręgowany stanowi dobry model do badania przebudowy mózgu po stresie w warunkach ostrych i hiperglikemicznych.

Pozwala ono również na badanie biodystrybucji cząsteczek znakowanych radioizotopowo oraz potencjalnych czynników terapeutycznych. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z francuskimi i europejskimi wytycznymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt w badaniach i zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną ds. eksperymentów na zwierzętach. Delikatnie złap rybę za pomocą siatki na ryby.

Umieść rybę w małej objętości anestetyku tricaine, rozcieńczonego do stężenia końcowego 0,02% w wodzie. Odczekaj, aż ryba przestanie się poruszać. Wyjmij rybę za pomocą uciętej pipety i delikatnie połóż ją na chłonnym papierze tkankowym, aby usunąć jak największą ilość wody.

Zważ rybę, aby przygotować strzykawkę z d-glukozą do iniekcji, w ilości 50 µL w dawce 2,5 g na kg masy ciała. Na przykład ryba o masie 0,6 g otrzyma 50 µL 3% roztworu d-glukozy w PBS. Połóż rybę na grzbiecie i przytrzymaj ją jedną ręką.

Drugą ręką wprowadź igłę strzykawki do jamy otrzewnej i powoli wstrzyknij roztwór d-glukozy w PBS. Wyjmij igłę i umieść rybę z powrotem w wodzie. Obserwuj rybę, aż całkowicie dojdzie do siebie.

Poziom glukozy we krwi mierzy się zazwyczaj po 1,5 godziny. Aby zasymulować przewlekłą hiperglikemię, należy przygotować dwulitrowy zbiornik z d-glukozą o końcowym stężeniu 111 mM. W tym celu odważyć 40 g d-glukozy i wsypać ją do pustego zbiornika.

Napełnij zbiornik dwoma litrami wody dla ryb i umieść w nim do siedmiu ryb. Wymieniaj roztwór glukozy co dwa dni, aby zapobiec wzrostowi bakterii lub innych mikroorganizmów. Przewlekłą hiperglikemię indukuje się poprzez 14-dniową kurację d-glukozą.

Odłów rybę za pomocą podbieraka i umieść ją w lodzie. Przykryj rybę lodem w celu szybkiej eutanazji. Wyjmij rybę i wytrzyj ją, aby usunąć wszelkie krople wody, które mogłyby rozcieńczyć próbki krwi.

Usunąć oko za pomocą pęsety sekcyjnej i odczekać, aż jama oczodołu wypełni się krwią. Umieścić pasek testowy w glukometrze, a następnie wprowadzić pasek do jamy oczodołu. Odczytać wartość stężenia glukozy we krwi.

W przypadku ostrej hiperglikemii, wstrzyknięcie d-glukozy do jamy otrzewnej indukuje znaczny wzrost poziomu glukozy we krwi, co pokazano w odstępie 1 1/2 godziny po iniekcji. W przypadku hiperglikemii przewlekłej, zanurzenie ryb w roztworze d-glukozy prowadzi do znacznego wzrostu poziomu glukozy we krwi, co pokazano po 14 dniach zabiegu. Na koniec procedury oddziel ciało od głowy za pomocą nożyczek sekcyjnych, a głowę umieść w 4% paraformaldehydzie rozcieńczonym w PBS do eksperymentów immunohistochemicznych.

Inkubować przez noc w temperaturze 4°C. Alternatywnie można bezpośrednio wyizolować mózg i zamrozić go do innych eksperymentów, takich jak ekstrakcja mRNA. Następnego dnia utrwalone głowy płucze się w roztworze PBS i unieruchamia za pomocą igły pod mikroskopem stereoskopowym.

Pozostałe oko zostaje usunięte, a górna część czaszki jest delikatnie otwierana za pomocą pęsety. Następnie mózg zostaje ostrożnie wyjęty i umieszczony w 1x PBS. Utrwalone mózgi są odwadniane stopniowo, w serii roztworów etanolu o rosnącym stężeniu, a następnie poddawane dwukrotnym, 30-minutowym kąpielom w toluenie.

Następnie mózgi umieszcza się w kasecie do zatapiania i ostrożnie zamyka pokrywkę. Kasetę należy umieścić w roztopionej parafinie w temperaturze od 58 do 60 °C. Podczas zatapiania mózgu w parafinie należy włączyć podgrzewane pincety do zatapiania.

Umieść kasetkę w czystej kąpieli parafinowej. Po zakończeniu cyklu kąpieli parafinowych wyjmij kasetkę. Wlej nieco parafiny ciekłej do formy.

Otwórz kasetkę i umieść mózg w roztopionej parafinie w formie. Ustaw mózg za pomocą ciepłych pęset do zatapiania. Wypełnij formę roztopioną parafiną i pozostaw do stężenia na chłodnicy urządzenia do zatapiania.

Z powodów technicznych mózg należy ustawić zgodnie z osią przednio-tylną. Po wyjęciu bloku parafinowego z formy, należy go przyciąć i zamocować w kasecie za pomocą roztopionej parafiny w orientacji umożliwiającej cięcie poprzeczne. Blok parafinowy należy umieścić w ramieniu mikrotomu i wykonywać skrawki o grubości 50 µm, aż do osiągnięcia poziomu próbki mózgu.

Następnie przytnąć blok parafiny, aby uzyskać kształt trapezu, i ustawić grubość skrawania na 7 µm. Zebrać wstążki parafiny za pomocą cienkiego pędzla i umieścić je na czarnym papierze. Przecinać wstążki parafiny co trzy do czterech skrawków.

Umieść szkiełko na płycie grzewczej i pokryj je wodą destylowaną. Ostrożnie ułóż skrawki na powierzchni wody na szkiełku i podgrzej do 40 °C. Gdy wstęgi parafiny zostaną odpowiednio rozprowadzone, usuń wodę za pomocą chłonnej chusteczki.

Ostatnie krople są usuwane mechanicznie, jak pokazano. Pozostawcie preparat do wyschnięcia na co najmniej dwie godziny przed przeprowadzeniem procedury immunohistochemicznej opisanej w protokole. Po przeprowadzeniu immunohistochemii preparaty są analizowane pod mikroskopem epifluorescencyjnym lub konfokalnym w celu zbadania wpływu hiperglikemii na proliferację komórek mózgu.

Ilościowe oznaczanie komórek mózgowych przeprowadza się na co najmniej trzech kolejnych przekrojach lub w wybranym obszarze zainteresowania. Tutaj komórki proliferujące, odpowiadające komórkom PCNA-dodatnim, są widoczne na zielono. Jak widać, przewlekła hiperglikemia indukuje spadek liczby komórek proliferujących, znakowanych na zielono przeciwciałem PCNA, w brzusznej części telencefalonu, grzbietowej części telencefalonu oraz w tylnej części podwzgórza, wokół recesu bocznego i tylnego.

Alternatywnie, w celu zbadania wpływu hiperglikemii na neurogenezę indukowaną urazem, podczas przewlekłej terapii hiperglikemicznej można wykonać uraz kłuty telencefalonu. W tym celu zanestezjować rybę poddaną siedmiodniowej terapii i umieścić ją pod mikroskopem stereoskopowym. Wprowadzić pionowo strzykawkę o rozmiarze 30 G przez czaszkę do centrum prawej półkuli telencefalonu.

Po zakończeniu tej procedury ryba powinna zostać zwrócona do zbiornika na wymagany czas. W tym przypadku rybie pozwolono przeżyć siedem dni w wodzie z d-glukozą przed uśmierceniem. Rana kłuta telencefalonu silnie zwiększa proliferację w uszkodzonej półkuli siedem dni po urazie.

Nasze dane wykazują, że przewlekła hiperglikemia powoduje znaczny spadek procesów gojenia w mózgu poprzez ograniczenie proliferacji komórek po ranie kłutej telencefalonu. Rybki zebrafish mogą być również wykorzystywane do badania biodystrybucji cząsteczek znakowanych radioaktywnie. W niniejszej pracy postanowiliśmy zbadać metabolizm glukozy w organizmie zebrafish.

Ryby należy najpierw znieczulić, a następnie umieścić na tkance nasączonej środkiem znieczulającym. Następnie rybę umieszcza się za szybą ochronną przeciwpromienną. Przygotowuje się strzykawkę zawierającą 50 µL fluorodeoksyglukozy.

Rybę ułożono na grzbiecie i wykonano wtrysk domięśniowy 50 µL FDG o aktywności 20 MBq. Następnie rybę umieszczono na innej tkance nasączonej środkami znieczulającymi. Zwierzę delikatnie owinięto i umieszczono w ramieniu skanera PET.

Ramię zostaje wprowadzone do skanera PET, a następnie przeprowadzana jest procedura obrazowania. Można tutaj zauważyć, że FDG jest wykrywane nie tylko w miejscu wstrzyknięcia, ale również w głowie ryby, w szczególności w mózgu, oraz wzdłuż całego rdzenia kręgowego. W niniejszym badaniu przedstawiamy dwie różne metody wywoływania ostrej i przewlekłej hiperglikemii u danio pręgowanych oraz wykazujemy, że hiperglikemia upośledza proliferację komórek mózgowych w warunkach prawidłowych oraz po wystąpieniu urazu.

Podsumowując, rybki danio-pręgowane mogą być wykorzystywane jako odpowiedni model do badania szkodliwych skutków hiperglikemii w ośrodkowym układzie nerwowym. Pozwalają one również na ocenę biodystrybucji cząsteczek znakowanych izotopowo za pomocą skanowania PET.