Spektrometria mas i podejścia oparte na luminogenice w celu scharakteryzowania kompetencji metabolicznych fazy I kultur komórkowych in vitro

Celem niniejszej procedury jest określenie aktywności cytochromów P450, lub CYP, w hodowlach komórkowych. CYP są kluczowymi enzymami uczestniczącymi w metabolizmie leków i toksyn, a ich ekspresja często nie jest zachowana in vitro. Prawidłowa ekspresja enzymów CYP jest często tracona podczas hodowli komórek in vitro.

W związku z tym wiele modeli in vitro potencjalnie ogranicza możliwość zrozumienia metabolizmu leków i substancji toksycznych. Główną zaletą tej metody jest jej prostota przy ocenie aktywności CYP w hodowlach komórkowych. Z wykorzystaniem substratów sond i inhibitorów przedstawiono różne platformy ilościowe, w tym spektrometrię mas.

Aby rozpocząć, należy przygotować probówki kriogeniczne z komórkami zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawiony protokół wykorzystuje linię komórek wątroby jako przykład. Pracując w warunkach sterylnych, należy ostrożnie otworzyć probówkę kriogeniczną, aby wyrównać ewentualne nadciśnienie, a następnie przenieść pipetą zawartość probówki do probówki o pojemności 10 ml wypełnionej 9 ml uprzednio ogrzanej do 37 °C pożywki Williams'E.

Wirować roztwór przez 10 minut przy 400 ×g w temperaturze pokojowej. Po odlaniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach zastrzeżonego medium do rozmrażania, podgrzanego wstępnie do 37 °C i uzupełnionego o glutaminę. Po policzeniu żywych komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, zasiać komórki na 24-dołkowej płytce powlekanej kolagenem w zagęszczeniu 60 000 żywych komórek na dołek, w końcowej objętości 0,5 mililitra medium do rozmrażania.

Po kilku dniach hodowli komórki tworzą subkonfluentną strukturę beleczkową. Optymalna aktywność metaboliczna jest zazwyczaj obserwowana między siódmym a dziesiątym dniem, natomiast najniższa w czwartym dniu. Aby przygotować hodowle zróżnicowanego nabłonka dróg oddechowych, należy wykorzystać dostępne komercyjnie w pełni zróżnicowane pierwotne nabłonki dróg oddechowych, które były hodowane na wkładce w warunkach interfejsu powietrze-ciecz.

Za pomocą sterylnej pęsety delikatnie wyjmij insert komórkowy z matrycy agarozowej i przenieś go na nową płytkę, do której wcześniej nalano 700 µL zastrzeżonego medium hodowlanego. Oceń integralność tkanki dróg oddechowych, stosując metody opisane w protokole tekstowym, takie jak oporność transepithelialna lub częstotliwość uderzeń rzęsek. Przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj dwie serie insertów komórkowych dla komórek dróg oddechowych oraz studzienek dla komórek wątroby, z minimum trzema powtórzeniami.

Jedną serię wykorzystaj do eksperymentu z inhibicją, a drugą wyłącznie do sondy metabolicznej. Przygotuj trzecią serię komórek jako kontrolę pustą z samym medium. W dniu eksperymentu zastąp pożywkę hodowlaną 450 µL świeżego medium.

Dodaj 50 µL pożywki zawierającej 10x inhibitor CYP do serii komórek przygotowanych do eksperymentu hamowania i inkubuj wstępnie przez 30 minut. Następnie wymień pożywkę w serii hamowania na 450 µL świeżej pożywki i dodaj 50 µL pożywki zawierającej zarówno 10x inhibitor CYP, jak i 10x substrat sondy. Dodaj 50 µL pożywki z 10x substratem sondy do pozostałych komórek, a następnie dodaj równoważną ilość rozpuszczalnika rozcieńczonego w pożywce do pustych kontrol komórkowych.

Po inkubowaniu komórek od zera do pięciu minut dla punktu czasowego jeden, kontroli tła zero, należy zebrać medium do oddzielnych, opisanych probówek i zamrozić je do późniejszej analizy. Następnie komórki dla punktu czasowego dwa inkubuje się przez 16 godzin w inkubatorze komórkowym. Po zakończeniu okresu inkubacji należy zebrać medium tą samą metodą w celu ilościowego oznaczenia produktu metabolicznego.

Przenieś 250 mikrolitrów medium inkubacyjnego do mikroprowetki o pojemności 1,5 mililitra i dodaj roztwór zapasu standardu wewnętrznego 4-metylumbeliferonu, aby osiągnąć stężenie końcowe 100 nanomolarów. Dostosuj pH medium do zakresu od 4,5 do 5,0, dodając HCl o stężeniu jeden mol przez litr w ilości jednego mikrolitra na raz. Zweryfikuj pH, n nanosząc od dwóch do 10 mikrolitrów medium na pasek wskaźnika pH, a następnie dodaj 150 jednostek betaglukuronidazy arylsulfatazy z Helix pomatia.

Po inkubacji przez jedną godzinę w temperaturze 37°C należy zatrzymać reakcję, dodając 250 µL zimnego metanolu. Rozpuszczalnik należy odparować za pomocą wirówki próżniowej w temperaturze 45°C. Próbki należy zrekonstytuować w 500 µL 30% roztworu acetonitrylu w wodzie.

Aby przeprowadzić ilościowe oznaczenie metodą spektrometrii mas, należy dodać 250 µL każdego standardu z serii rozcieńczeń do bursztynowej fiolki szklanej do ultrawydajnej chromatografii cieczowej, przeznaczonej do wstrzykiwania do autosamplera UPLC-MS. Próbki badawcze należy również dodać do bursztynowych fiolek UPLC i umieścić je w autosamplerze UPLC. Po zrandomizowaniu wszystkich fiolek należy uruchomić analizę UPLC-MS, stosując ustawienia szczegółowo opisane w protokole tekstowym, w zależności od konkretnej badanej sondy.

Użyj narzędzia Quantitate, Build Quantitation Method w narzędziach do kwantyfikacji spektrometru mas, aby wygenerować krzywą kalibracyjną z pozyskanego standardu syntetycznego i standardu wewnętrznego, a następnie użyj Kreatora Kwantyfikacji (Quantitation Wizard), aby wybrać partię próbek oraz próbki do analizy ilościowej i uruchomić metodę kwantyfikacji. Aby indukowć CYP1A1, CYP1B1, zastosuj układ płyt opisany w protokole tekstowym. Inkubuj komórki przeznaczone do indukcji w pożywce z końcowym stężeniem 10 nanomolar TCDD przez okres 72 godzin.

Po tym okresie usunąć pożywkę, trzykrotnie przemyć studzienki buforem PBS i dodać świeżą pożywkę. Przed inkubacją komórek z luminogeniczną sondą reporterową, wyznaczoną podgrupę indukowanych komórek inkubować wstępnie przez 30 minut z inhibitorem CYP1A1, CYP1B1 w pożywce. Dodać sondę luminogeniczną, 6'chloroethyl ether lucyferyny, do końcowego stężenia 50 micromolar do komórek nieindukowanych, indukowanych oraz indukowanych z inhibitorem.

Inkubować przez cztery godziny, a następnie przenieść 25 µL pożywki hodowlanej do białej, nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej i dodać 25 µL odczynnika detekcyjnego lucyferyny dostarczonego przez producenta. Po inkubacji przez 20 minut w temperaturze pokojowej niezwłocznie odczytać płytkę za pomocą luminometru. Przedstawiono tutaj względną luminescencję powstałą w wyniku dealkilacji eteru 6'-chloroetylowego lucyferyny, katalizowanej przez CYP1A1 i CYP1B1.

Przykład pokazuje brak aktywności enzymatycznej w warunkach bez indukcji TCDD. Po indukcji TCDD obserwuje się aktywność CYP1A1 oraz CYP1B1 zarówno w komórkach wątrobowych, jak i oddechowych. Na koniec dodanie inhibitora CYP1A1 i CYP1B1, alfa-naftoflawonu, redukuje lub eliminuje aktywność CYP.

W celu oceny aktywności CYP2A6 i 2A13 w typach komórek wątroby i dróg oddechowych zmierzono ilość 7-hydroksykumaryny powstałej w wyniku hydroksylacji kumaryny przez enzym, wykorzystując metodę UPLC LC-MS. W czasie zero minut inkubacji z kumaryną wykryto jedynie sygnał tła. Po 16 godzinach zaobserwowano hydroksylację kumaryny z utworzeniem 7-hydroksykumaryny w obu typach komórek.

Wreszcie, dodanie inhibitora CYP2A, 2A13 zapobiega tworzeniu się 7-hydroksykumaryny. Po opanowaniu metody, etapy inkubacji sondy i kwantyfikacji w tej technice można w większości przypadków przeprowadzić w czasie od kilku godzin do jednego dnia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania różnych testów metabolizmu fazy pierwszej z wykorzystaniem różnych typów komórek, potwierdzając swoistość enzymu poprzez inhibicję i/lub indukcję, zgodnie z potrzebami.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że różne typy komórek mogą wymagać dłuższego czasu inkubacji, a niezbędne jest uwzględnienie typu komórek, który może służyć jako kontrola pozytywna. Należy pamiętać, że praca z TCDD może być niezwykle niebezpieczna i podczas przeprowadzania tej procedury zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak pełny sprzęt ochrony osobistej. Zastosowania tej techniki obejmują wykorzystanie odpowiednich modeli in vitro do oceny przedklinicznej nowych leków oraz oceny ryzyka substancji chemicznych i składników stosowanych w produktach konsumenckich.