Siłownik oparty na komórkach mięśnia sercowego i samostabilizujący się biorobot - część 2
9 maja 2017
W tym badaniu, biologiczny aktywator i samostabilizujący się, pływający biorobot z funkcjonalizowanymi elastomerowymi ramionami wspornikowymi są obsiewane kardiomiocytami, hodowane i charakteryzowane pod kątem ich biochemicznych i biomechanicznych właściwości w czasie.
Ogólnym celem niniejszego badania jest zasiedlenie mikrofabrykowanych urządzeń komórkami mięśnia sercowego oraz charakterystyka właściwości biochemicznych i biomechanicznych komórek na tych urządzeniach, a także ocena ich wydajności w czasie. Opisana tutaj metoda może zostać łatwo zmodyfikowana na potrzeby innych eksperymentów wymagających wysokiej gęstości wysiewu komórek na urządzeniach mikrofabrykowanych. Główną zaletą bioaktuatora opracowanego w tym filmie jest możliwość jego łatwego dostosowania do ilościowego pomiaru sił skurczu dowolnego innego typu komórek.
Można go również wykorzystać do badania zmian w charakterystyce biomechanicznej komórek macierzystych podczas ich różnicowania. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy wysiewania komórek są trudne do opanowania na podstawie samych opisów tekstowych. Muszą one być przeprowadzone prawidłowo, aby zapewnić konfluencyjne przyleganie komórek do ramion wspornika, co jest niezbędne dla prawidłowej funkcji biologicznej.
Procedurę zaprezentuje Neerajha Nagarajan z mojego laboratorium. Korzystając z biorobota, należy rozpocząć pracę w kolbie T25. Użyj magnesu, aby utrzymać go w miejscu na dnie kolby.
Magnes nie jest potrzebny w przypadku siłowników biologicznych, ponieważ nie będą one przemieszczone ze względu na ciężar szklanego koralika w podstawie. Zwiń mały kwadratowy arkusz plastiku, aby stworzyć lejek, a następnie umieść sterylny lejek nad siłownikami w biorobotach. Dostosuj średnicę szerszego końca tak, aby pasował do urządzenia, oraz wysokość, tak aby lejek przylegał ściśle po dokręceniu górnej części kolby.
Użyj osobnej kolby, aby sprawdzić i dopasować szczelność lejka. Ścisłe dopasowanie lejka zapewni brak wycieku komórek do pozostałej części medium, o czym wspomniano wcześniej. Jest to niezbędne do uzyskania konfluentnego pokrycia ramienia wspornika.
Po umieszczeniu lejka resuspendować kardiomiocyty w pełnej pożywce DMEM z zagęszczeniem 16 milionów komórek na mililitr, a następnie powoli nalać 400 µL zawiesiny na urządzenia przez każdy lejek. Następnie powoli przenieść kolby z powrotem do inkubatora, nie naruszając urządzeń ani znajdujących się w nich lijków. Pozostawić komórki do przyczepienia na 24 godziny w temperaturze 37 °C.
Po okresie inkubacji powoli usuń lejek. Ostrożnie przemyj próbki buforem PBS i napełnij każdą kolbę 10 ml świeżej pożywki DMEM complete. Następnie usuń magnes z biorobota, tak aby próbki swobodnie pływały, i umieść kolby z powrotem w inkubatorze.
Zamontuj w inkubatorze kamerę wyposażoną w obiektyw z zoomem, aby wizualizować urządzenia w hodowli. Następnie dodaj pasek oświetlenia LED, który posłuży jako źródło światła. W kolejnym kroku podłącz kamerę do komputera i uruchom program do obrazowania.
Po uruchomieniu programu kliknij obraz aparatu w karcie File, aby otworzyć wszystkie opcje kamery i wybrać podłączone urządzenie. Z listy kart wybierz Live i ręcznie ustaw ostrość obrazu, regulując pierścień obiektywu. Następnie w górnym panelu wybierz przycięcie obszaru zainteresowania (crop of the region of interest).
Następnie ręcznie narysuj w klatce wideo prostokąt obejmujący biologiczny element wykonawczy oraz ramiona wspornikowe, aby zaznaczyć obszar zainteresowania. W przypadku biorobotów uchwyć cały ekran, aby zarejestrować ruch pływający urządzenia. Następnie wybierz Ustawienia Kamery i ustaw częstotliwość klatek, regulując czas naświetlania oraz stosunek pikseli obrazu na żywo.
Ustaw częstotliwość klatek na około 30 klatek na sekundę. Na koniec kliknij przycisk nagrywania, aby rozpocząć nagrywanie filmów. Otwórz oprogramowanie programistyczne, klikając odpowiednią ikonę.
Po załadowaniu programu kliknij Plik, Otwórz i wybierz plik skryptu m do przeprowadzenia analizy obrazu. Upewnij się, że zarejestrowane obrazy TIF oraz ich wersje AVI znajdują się w tym samym folderze co plik m, a następnie kliknij Uruchom, aby uruchomić skrypt. Naciśnij Play, aby rozpocząć właściwy program.
Po uruchomieniu programu kliknij przycisk Open i zlokalizuj plik TIF lub AVI, który ma zostać poddany analizie. Następnie kliknij przycisk base. Wybierz punkt, w którym wspornik łączy się z podstawą u góry, i naciśnij Enter.
Dzięki temu na obrazie w każdej klatce zostanie umieszczony kwadratowy znacznik wskazujący położenie podstawy wspornika. Następnie kliknij przycisk skali, a potem ręcznie kliknij na jednej krawędzi szklanej kuleczki. Przenieś wskaźnik myszy na przeciwległą stronę szklanej kuleczki i naciśnij Enter.
Spowoduje to narysowanie linii mierzącej średnicę szklanej kulki i powiąże średnicę z wyświetlanymi pikselami. Kliknij przycisk Analyze. Następnie kliknij wzdłuż wspornika w krótkiej odległości od pierwszego kwadratowego znacznika reprezentującego podstawę wspornika.
Nadal klikaj wzdłuż wspornika, wliczając w to jego końcówkę, a po zakończeniu naciśnij Enter. Spowoduje to umieszczenie znaku X w każdym punkcie klikniętym na wsporniku. Na koniec sprawdź, czy nałożone koło prawidłowo odwzorowuje profil wspornika.
Jeśli wynik jest poprawny, kliknij przycisk następnej klatki. Przełączy to widok na kolejną klatkę w pliku TIF. Powtórz ten proces dla wszystkich klatek.
Po przetworzeniu wszystkich klatek kliknij przycisk Eksportuj. Rozpocznij od uruchomienia oprogramowania do analizy obrazu i wczytania pliku wideo z pływającym biorobotem. Następnie otwórz program do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.
W załadowanym filmie z biorobota zlokalizuj punkt odniesienia wielkości, taki jak szklana kuleczka. Użyj narzędzia Straight (Linia), aby narysować linię przez szklaną kuleczkę. Następnie kliknij Analyze (Analiza) i wybierz Set Scale (Ustaw skalę).
W polu Known distance ustaw wartość 3, 000 micrometers i kliknij OK. Wybierz punkt na urządzeniu, który nie drga pomiędzy klatkami, aby służył jako znacznik, a następnie zapisz współrzędne X i Y tego punktu w arkuszu kalkulacyjnym. Powróć do okna oprogramowania do analizy obrazu i naciśnij prawą strzałkę, aby przejść do następnej klatki. Wskaż ponownie znacznik i zapisz nowe współrzędne X i Y w arkuszu kalkulacyjnym.
Powtórz ten proces dla wszystkich klatek i wykorzystaj uzyskane dane do analizy ruchu biorobota zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Statyczne i dynamiczne naprężenia siłownika zostały wyodrębnione z naprężeń powierzchniowych każdego dnia. Naprężenie statyczne to naprężenie skurczowe, jakie komórki wywierają na powierzchnię w stanie spoczynku, natomiast naprężenie dynamiczne to naprężenie generowane przez komórki przy maksymalnym skurczu.
W miarę dojrzewania komórek w hodowli, z czasem zaobserwowano stopniowy wzrost naprężeń statycznych i dynamicznych. W szóstym dniu wykazały one maksymalną siłę trakcyjną komórek wynoszącą 50 millinewtons per meter oraz maksymalną siłę skurczu wynoszącą około 165 millinewtons per meter. Równolegle do naprężeń statycznych i dynamicznych, markery dojrzewania kardiomiocytów, wzrostu i rozprzestrzeniania się oraz wzajemnych połączeń komórkowych również wzrastały aż do szóstego dnia.
Na podstawie analizy wideo przedstawiono tutaj porównanie średniej prędkości pływania, częstotliwości uderzeń oraz dystansu pokonywanego przy jednym ruchu dla trzech biorobotów o różnych profilach pływania. Choć bioroboty pionowe charakteryzowały się najniższą częstotliwością uderzeń, wykazały one najwyższą prędkość pływania i największy przebyty dystans. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wysiewać komórki mięśnia sercowego na mikrofabrykowanych urządzeniach, które mogą pełnić funkcję biologicznych aktuatorów i biorobotów.
Proces akwizycji obrazu i późniejsza analiza danych opisane w tym filmie demonstrują wygodny sposób charakteryzacji zachowania komórek, jak również wydajności urządzenia. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że czas życia kardiomiocytów jest ograniczony, a aktywność komórek osiąga szczyt szóstego dnia, po czym z czasem ulega ona zmniejszeniu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na zasiedlaniu mikrofabrykowanych urządzeń komórkami mięśnia sercowego oraz charakteryzacji ich właściwości biochemicznych i biomechanicznych w czasie. Opracowany bioaktuator umożliwia kwantyfikację sił skurczu komórek oraz badanie różnicowania komórek macierzystych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Aktuatory biologiczne
- Kultura kardiomiocytów
- Charakterystyka biomechaniczna
Wprowadzenie
- Urządzenia mikrofabricated są niezbędne do badania zachowania komórek.
- Komórki mięśnia sercowego (kardiomiocyty) mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia funkcji serca.
- Charakteryzacja komórek na takich urządzeniach może dostarczyć istotnych informacji.
- Prawidłowe wysiewanie komórek jest krytyczne dla ich funkcji biologicznych.
Cel badania
- Opracowanie metody wysokogęstościowego wysiewu komórek na urządzeniach mikrofabrykowanych.
- Charakterystyka wydajności kardiomiocytów w czasie.
- Przedstawienie wizualnej demonstracji technik wysiewu komórek.
Zastosowane metody
- Wysiew kardiomiocytów na elastomerowych ramionach wspornikowych.
- Kultywowanie i monitorowanie właściwości biochemicznych.
- Ocena właściwości biomechanicznych w czasie.
- Demonstracje wizualne wspomagające naukę technik wysiewu komórek.
Główne wyniki
- Pomyślne wysiewanie kardiomiocytów na urządzeniach mikrofabrykowanych.
- Osiągnięcie charakterystyki właściwości biochemicznych i biomechanicznych.
- Wykazanie zdolności do ilościowego określania sił skurczu komórek.
- Metoda możliwa do zaadaptowania dla innych typów komórek i badań.
Wnioski
- Opracowany bioaktuator może być wykorzystywany dla różnych typów komórek.
- Metody wizualne usprawniają zrozumienie złożonego procesu zasiewu komórek.
- Wyniki przyczyniają się do rozwoju inżynierii tkankowej oraz medycyny regeneracyjnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza praca ustanawia skalowalną platformę do kwantyfikacji sił skurczowych kardiomiocytów, umożliwiając mechanistyczną redukcję ryzyka w procesie walidacji celów terapeutycznych serca oraz przesiewu fenotypowego. Poprzez dostarczenie ilościowych odczytów biomechanicznych, system ten zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących związków oraz wyborze modeli przedklinicznych dla terapii układu sercowo-naczyniowego. Adaptacyjność systemu do innych typów komórek zwiększa jego użyteczność w procesach badawczych wymagających funkcjonalnej oceny tkanek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez bezpośredni pomiar sił skurczowych generowanych przez komórki jako funkcjonalny odczyt stopnia oddziaływania z celem molekularnym.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez ilościowe określanie dojrzałości kardiomiocytów i ich integracji funkcjonalnej w czasie, co zmniejsza niejednoznaczność w zakresie mechanizmu działania celu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje standaryzowane, ilościowe dane biomechaniczne (stres statyczny/dynamiczny, częstotliwość skurczów, prędkość pływania), które są odpowiednie do opracowywania testów i przesiewania związków.
- Wartość operacyjna: Zapewnia gotowość testu poprzez powtarzalne wysiewanie komórek i tworzenie zlewnej warstwy, co umożliwia wiarygodną ocenę związków w badaniach nad układem sercowo-naczyniowym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Dostarcza istotnych z punktu widzenia choroby informacji o systemie poprzez powiązanie markerów dojrzewania kardiomiocytów z wydajnością funkcjonalną, co wspiera dopasowanie biomarkerów translacyjnych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju w oparciu o analizę ryzyka poprzez monitorowanie spadku funkcji po osiągnięciu szczytowej aktywności, co pozwala na ocenę ciągłości badań przedklinicznych i segregację portfela projektów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną, dostarczając dane funkcjonalne, które stanowią podstawę do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań na każdym z tych etapów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez korelację perturbacji genetycznych lub farmakologicznych ze zmianami siły skurczu i stresu komórkowego.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analiz oraz powtarzalność dzięki zestandaryzowanym protokołom wysiewania komórek i mierzalnym odczytom biomechanicznym w wielu punktach czasowych.
- Analityka: Umożliwia pomiary rozdzielone w czasie w zakresie stresu statycznego/dynamicznego, częstotliwości skurczów oraz wskaźników napędowych, co pozwala na analizę porównawczą efektów działania związków lub modyfikacji genetycznych.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, wykazując ciągłość w funkcjonalnym dojrzewaniu kardiomiocytów oraz śledzeniu wydajności z wykorzystaniem urządzeń.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma, którą można dostosować do różnych typów komórek i schematów badań, maksymalizując zwrot z inwestycji (ROI) w wielu obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną dzięki ilościowej, rozdzielczej w czasie charakterystyce biomechanicznej kurczliwości i dojrzewania komórek.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i skalowalność poprzez zdefiniowane protokoły wysiewania, obrazowania i analizy, które minimalizują zmienność zależną od użytkownika.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez redukcję biologicznego ryzyka na późnych etapach dzięki wczesnej funkcjonalnej ocenie ryzyka celów kardiologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczenie obiektywnych, ilościowych wskaźników do porównywania głównych kandydatów lub modeli chorób.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli pierwotnych kardiomiocytów, obsłudze mikrofabrykacji oraz analizie obrazów time-lapse.
- Zależy od dostępu do inkubatorów z możliwością obrazowania, obiektywów zoom, oświetlenia LED oraz oprogramowania do śledzenia ruchu i obliczania naprężeń.
- Wymaga standaryzacji gęstości wysiewu, wykonania lejków oraz ustawień częstotliwości klatek między zespołami w celu zapewnienia powtarzalnych wyników w różnych ośrodkach.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów przy rozszerzeniu metody na typy komórek inne niż kardiomiocyty, w tym funkcjonalizację powierzchni i harmonogramy dojrzewania.
- Ograniczone przez skończoną żywotność pierwotnych kardiomiocytów, których szczytowa aktywność przypada około szóstego dnia, co wymaga terminowej realizacji eksperymentu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Cell Seeding and Culture of the Biorobots and Actuators
2:52
Imaging Biorobots and Actuators
4:14
Image Analysis of the Biological Actuators on a Stationary Base
6:01
Analysis of Swimming Biorobots
7:20
Results: Biomechanical Analysis of Cardiomyocyte-loaded Actuators and Biorobots
8:41
Conclusion
