Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie procedur wymaganych do pomyślnego wyhodowania genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikrowstrzyknięcie oocytów. Protokół ten może pomóc naukowcom i personelowi technicznemu zaangażowanym zarówno w dziedzinę genezy myszy, jak i w celowanie w geny. Główną zaletą tej techniki jest to, że opiera się ona na bezpośrednim wstrzykiwaniu mysich oocytów, zarówno w celu losowej integracji, jak i celowania w geny, co pozwala na wytworzenie genetycznie zmodyfikowanych myszy w ciągu zaledwie sześciu tygodni.

Aby przygotować pojedynczy przewodnik RNA, po wybraniu żądanych dwóch sekwencji docelowych i wykonaniu starterów zgodnie z protokołem tekstowym, zsyntetyzuj liniową matrycę DNA, rozcieńczając plazmid PX330 do 10 nanogramów na mikrolitr w wodzie wolnej od nukleaz. Przygotuj mieszankę wzorcową, dodając polimerazę na końcu i trzymaj na lodzie. Następnie wymieszaj i podziel roztwór na osiem probówek PCR.

Dodaj jeden mikrolitr PXR330 na probówkę i uruchom następujący program. Następnie użyj zestawu do oczyszczania PCR, kolektora i źródła podciśnienia do oczyszczenia produktu PCR. Dodać pięć objętości buforu wiążącego do jednej objętości próbki PCR i wymieszać.

Umieść kolumnę wirującą z membraną krzemową na kolektorze. Aby związać DNA, nałóż wszystkie osiem próbek do kolumny w próżni. Aby przepłukać próbkę, dodaj 0,75 mililitra buforu do przemywania do kolumny i odkurz.

Następnie odwirować kolumnę przy 12 000 razy G przez 60 sekund, aby wyeliminować resztki etanolu. Umieść kolumnę w czystej 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej, a następnie, aby wymyć DNA, dodaj 30 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do środka membrany. Odstawić kolumnę na minutę i odwirować ją 12 000 razy G przez 60 sekund.

Następnie użyj spektrofotometru, aby zmierzyć stężenie DNA. Aby przeprowadzić transkrypcję in vitro przy użyciu zestawu do syntezy RNA t7, należy przygotować mieszankę wzorcową i inkubować reakcję w termocyklerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Dodaj 28 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz i dwa mikrolitry DNAzy jeden i inkubuj reakcję przez kolejne 15 minut.

Aby oczyścić RNA, rozpuść proszek zawarty w dostarczonej kolumnie wirowej i 650 mikrolitrach wolnego od nukleaz buforu do mikroiniekcji. Ostrożnie usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza, zakryj probówkę i nawadniaj roztwór w temperaturze pokojowej przez pięć do 15 minut. Zdejmij niebieską nasadkę na dole i umieść kolumnę w dwumililitrowej tubie.

Następnie odwirować probówkę o temperaturze 750 razy G w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Następnie umieść kolumnę w świeżej 1,5 mililitrowej probówce i nałóż 50 mikrolitrów roztworu RNA kroplami do środka, nie dotykając ścianki kolumny. Następnie obracaj kolumnę z prędkością 750 razy G przez dwie minuty.

Zmierz stężenie RNA i oceń jakość RNA zgodnie z protokołem tekstowym. Używając buforu do mikroiniekcji bez nukleazy, rozcieńczyć przypadek dziewięciu mRNA do 50 nanogramów na mikrolitr, a sgRNA do 12,5 nanogramów na mikrolitr do eksperymentów z nokautem genów. Dodaj matrycę dawcy w stężeniu 200 nanogramów na mikrolitr, do edycji genomu w oparciu o bezpośrednią naprawę homologii i utrzymuj ją na lodzie.

Za pomocą ustnika aspiratora przemyć oocyty czterema świeżymi kroplami aminokwasów kazeinowych. I przenieś je do ostatniej kropli pożywki casome eight, pokrytej olejem mineralnym. Aby przeprowadzić pro nuclear injection w celu losowej integracji, pod mikroskopem stereoskopowym, użyj ustnika aspiratora, aby przekształcić około 50 jaj w kroplę m2 pożywki, pokrytą olejem mineralnym, który będzie używany jako komora iniekcyjna.

Przenieść komorę iniekcyjną do mikroskopu odwróconego i wstrzyknąć do zapłodnionych oocytów kilka pikolitrów mieszanki iniekcyjnej. Przedjądrze puchnie, jeśli wstrzyknięcie się powiedzie. Wykonaj wstrzyknięcie cytoplazmatyczne w celu ukierunkowania genu, użyj ustnika, aby przenieść około 50 jaj do kropli kasomu A, zawierającej pięć mikrogramów na mililitr cytochalazyny B i inkubuj jaja w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez pięć minut.

Przenieś jaja do komory iniekcyjnej, a następnie, pod bardzo niskim ciśnieniem, wstrzyknij kilka pikolitrów mieszanki iniekcyjnej do cytoplazmy. Tam, gdzie to możliwe, przy użyciu ciśnienia kompensacyjnego automatycznego mikrowtryskiwacza. Po wstrzyknięciu należy użyć ustnika, aby przenieść oocyty z powrotem do kropli kasomeaminokwasów.

Utrzymuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, dopóki nie zostaną załadowane do ponownego zagnieżdżenia się w jajowodzie pseudo ciężarnych samic. Po znieczuleniu podłączonej samicy myszy zgodnie z protokołem tekstowym, w celu przeprowadzenia ponownej implantacji w sterylnych warunkach, należy wystawić układ rozrodczy za pomocą skalpela na nacięcie o długości jednego centymetra równoległe do grzbietowej linii środkowej. Następnie nożyczkami przetnij mięsień i użyj kleszczy, aby chwycić poduszeczkę tłuszczową.

Delikatnie wyciągnij jajnik, aż jego przyczepiony jajowód i macica będą wyraźnie widoczne. Następnie użyj zacisku do naczynia, aby przymocować poduszeczkę tłuszczową. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj pary mikronożyczek, aby wykonać nacięcie w ścianie jajowodu, kilka milimetrów przed bańką.

Ponadto, pod mikroskopem stereoskopowym, załaduj 25 mikro wstrzykniętych jaj do szklanej kapilary połączonej z ustnikiem. Następnie włóż szklaną kapilarnę do jajowodu i wydalaj jaja, aż pęcherzyk powietrza będzie widoczny wewnątrz bańki. Aby upewnić się, że ponowna implantacja zakończyła się sukcesem, należy sprawdzić, czy w bańce nie ma pęcherzyków powietrza, co gwarantuje, że wszystkie jaja zostały wydalone we właściwym miejscu i żadne nie pozostało w szklanej kapilarze.

Delikatnie usuń szklaną naczynkę i umieść układ rozrodczy z powrotem w jamie brzusznej. Następnie użyj trzech zerowych, niewchłanialnych szwów chirurgicznych, aby zszyć nacięcie, a następnie użyj klipsów do ran, aby zamknąć skórę. Umieść mysz na ciepłej macie, aby uniknąć hipotermii, i wstrzyknij podskórnie środek przeciwbólowy.

Monitoruj mysz aż do pełnego odzyskania sprawności. Na koniec przeprowadź typowanie i sekwencjonowanie genomu zgodnie z protokołem tekstowym. Rysunek ten przedstawia żele analityczne demonstrujące jakość oczyszczania transgenu i syntezy sgRNA, które mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego wyhodowania genetycznie zmodyfikowanych myszy.

Pokazany tutaj jest typowy odczyt sesji mikroiniekcji w celu losowej integracji. Starter genotypowania powinien znajdować się na transgenie i powinien być zaprojektowany tak, aby generować fragment od 200 do 800 par zasad. W tym odczytaniu dla celowania genów, startery dla wybranych do hybrydyzacji z genomowym DNA poza regionem ostatecznie wycięte przez dwóch facetów.

Strategia ta pozwala na bezpośrednią identyfikację heterozygotycznych i homozygotycznych założycieli knock out. Jak pokazano tutaj, gdy każdy etap protokołu jest optymalizowany, odsetek transgenicznych szczeniąt powinien osiągnąć od 10% do 25% w przypadku losowej integracji, co jest nieco niskie w porównaniu ze zdolnością komponentów CRISPR do edycji genomu myszy. Używając CRISPR do celowania w geny, liczba założycieli jest na ogół wyższa, wahając się od 25% do 100%, nierzadko uzyskuje się całe potomstwo, które jest z powodzeniem homozygotyczne po edycji za pomocą CRISPR.

Po opracowaniu, technika ta pozwala naukowcom z dziedzin takich jak neurobiologia czy rak, na przykład używać nowych modeli masek do odkrywania mechanizmów patologicznych i ostatecznie przekładania ich na strategie terapeutyczne.