Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Ogólnym celem niniejszej procedury jest bezpośrednia obserwacja neuronów migrujących radialnie w organotypowej hodowli plastrów przygotowanej z elektroporowanego zarodkowego mózgu przy użyciu konfokalnej mikroskopii poklatkowej. Metoda ta może pomóc w badaniu kluczowych aspektów rozwoju neocortex. Pozwala ona na analizę mechanizmów molekularnych zaangażowanych w polaryzację neuronów oraz ich migrację radialną do docelowej pozycji w obrębie mózgu.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość analizy właściwości dynamicznych migrujących neuronów, w tym profili prędkości, średniej prędkości migracji oraz zmian kierunku migracji. Rozpocznij od umieszczenia odpowiednio znieczulonej ciężarnej myszy w pozycji grzbietowej na płycie grzewczej. Sprawdź brak odruchu stopowego.

Następnie należy ostrożnie pokryć oczy wazeliną, aby zapobiec ich wysychaniu. Potem delikatnie rozsunąć kończyny i przymocować je do płyty grzewczej za pomocą taśmy chirurgicznej. Brzuch należy wysterylizować, przecierając go 70% ethanol, a następnie roztworem jodu, po czym na brzuchu należy położyć sterylną gazę z wykonanym nacięciem pod cięcie brzuszne.

Zwilż gazę bakteriostatycznym roztworem chlorku sodu. Po ponownej ocenie głębokości znieczulenia chirurgicznego poprzez sprawdzenie utraty odruchu stopy, użyj ząbkowanej mikropincety Adsona i zakrzywionych nożyczek precyzyjnych, aby naciąć skórę na długości około 1,5 centymetra wzdłuż linii środkowej brzucha. Następnie przetnij znajdujący się pod skórą mięsień wzdłuż białej linii brzusznej.

Uchwyć róg macicy pomiędzy embrionami za pomocą kleszczy pierścieniowych i delikatnie połóż go na zwilżonej gazie, nie naruszając łożysk ani naczyń doprowadzających. Następnie ostrożnie ustaw embrion tak, aby uzyskać wyraźny widok komory bocznej, która przejawia się jako cień w kształcie półksiężyca przebiegający równolegle do zatoki strzałkowej. Miejsce wstrzyknięcia znajduje się w połowie linii łączącej pigmentowane oko z splotem zatok, w miejscu, gdzie zatoka strzałkowa rozgałęzia się na dwie zatoki przenoszące.

Po zidentyfikowaniu odpowiedniego miejsca, wprowadzić igłę do mikroiniekcji przez ścianę macicy do komory bocznej. Następnie, używając mikroinjektora sterowanego pedałem nożnym, wstrzyknąć od 1 do 2 µL roztworu DNA w 5 do 10 pulsach. Prawidłowe wykonanie iniekcji można monitorować dzięki barwionemu roztworowi DNA, który powinien wypełnić układ komorowy.

Następnie umieść elektrody typu pęsetowego tak, aby biegun dodatni znajdował się po tej samej stronie co wstrzyknięty komora mózgu, a biegun ujemny po przeciwnej stronie wstrzykniętej komory, poniżej ucha głowy zarodka. Zwilż miejsce elektroporacji kilkoma kroplami bakteriostatycznego roztworu chlorku sodu i zastosuj pięć impulsów prądu elektrycznego o czasie trwania 50 ms w odstępach 950 ms. Pęcherzyki powietrza przy elektrodzie ujemnej wskazują na przepływ prądu elektrycznego.

Do skutecznej elektroporacji zazwyczaj wystarczające jest natężenie od 60 do 90 mA. Niższe natężenia nie zapewnią wydajnej transfekcji neuronów, natomiast wyższe mogą doprowadzić do śmierci zarodkowej. Po powtórzeniu tej procedury dla każdego embrionu z pierwszego rogu macicy, delikatnie umieść go z powrotem w jamie brzusznej.

Po zaszyciu warstwy mięśniowej i skóry należy starannie zdezynfekować miejsce operacji roztworem jodyny i delikatnie usunąć wazelinę z oczu za pomocą wacików celulozowych. Umieścić mysz pod lampą podczerwieni aż do momentu wybudzenia. Po eutanazji ciężarnej samicy metodą zatwierdzoną przez komisję, wyciąć macicę zawierającą embriony i umieścić ją w 10-centymetrowej płytce Petriego z lodowatym, kompletnym roztworem HBSS.

Od tego momentu wszystkie roztwory, embriony i mózgi należy przechowywać w lodzie. Pracując pod stereomikroskopem, należy użyć pęsety z cienkimi końcówkami oraz nożyczek sprężynowych Vannas Tubingen, aby oddzielić każdy embrion od macicy. Następnie należy przenieść embriony do innej szalki Petriego zawierającej lodowaty kompletny HBSS.

Wykonaj nacięcie na poziomie pnia mózgu i przetnij wzdłuż linii środkowej w płaszczyźnie strzałkowej. Odchyl skórę i chrząstkę pokrywającą mózg. Następnie odetnij pień mózgu bezpośrednio za półkulami i wyjmij mózg z czaszki.

Przenieś mózg za pomocą mikroszpatułki do płytki 12-dołkowej zawierającej schłodzony do temperatury lodu kompletny roztwór HBSS. Zbierz wszystkie mózgi z miotu w jednej płytce 12-dołkowej. Następnie użyj fluorescencyjnego stereomikroskopu, aby ocenić mózgi w płytce pod kątem natężenia fluorescencji oraz wielkości obszaru poddanego elektroporacji.

Wybierz od dwóch do czterech mózgów z silnym sygnałem fluorescencyjnym i widoczną korą somatosensoryczną do dalszej obróbki. Następnie wlej stopiony 3% roztwór agarozy niskotopliwej do jednorazowej formy do zatapiania z możliwością odrywania ścianek. Za pomocą mikrołopatki wyjmij mózg z płytki 12-dołkowej i ostrożnie osusz nadmiar kompletnego roztworu HBSS wokół mózgu, używając drobnoziarnistego papieru do tkanek.

Ostrożnie umieść mózg w roztworze agarozy. Następnie, używając igły 20 G, dociśnij go do dna formy i starannie skoryguj jego pozycję. W przypadku przekrojów wieńcowych (koronalnych), zorientuj mózg tak, aby opłaty węchowe były skierowane ku górze.

Przechowywać formę w lodu, aż roztwór agarozy stężeje, a następnie przystąpić do sekcjonowania mózgu. Za pomocą czystej żyletki odciąć nadmiar agarozy wokół mózgu, pozostawiając około jeden milimetr agarozy z każdej strony, z wyjątkiem cebulek węchowych, gdzie należy pozostawić od dwóch do trzech milimetrów agarozy. Po nałożeniu niewielkiej ilości kleju cyjanoakrylowego na podłoże, przymocować przyciętą kostkę agarozy tak, aby cebulki węchowe były skierowane w dół.

Przenieś platformę z preparatem do komory tnącej mikrotomu z wibracyjnym nożem zawierającej lodowaty, kompletny roztwór HBSS i ustaw mózg stroną grzbietową w stronę noża. Wykonaj przekroje mózgu o grubości 250 micron obejmujące obszar poddany elektroporacji, stosując niską lub umiarkowaną amplitudę oraz bardzo niską prędkość cięcia. Z każdego pomyślnie poddanego elektroporacji mózgu zazwyczaj uzyskuje się od czterech do sześciu przekrojów z jasnym sygnałem fluorescencyjnym.

Chwyć krawędź agarozy jednego przekroju za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami i przenieś go na wygiętą mikrołopatkę. W ten sposób ostrożnie przenieś przekroje mózgu do płytki sześciodołkowej zawierającej lodowaty kompletny HBSS. Zwilż wkładki z membran powlekanych lamininą 100 µL kompletnego HBSS.

Następnie, ostrożnie przenieś plasterki na membrany, używając wygiętej mikroszpatułki i pęsety. Delikatnie przesuń plasterek ze szpatułki na membranę, a następnie ustaw go za pomocą pęsety. Kontynuuj przenoszenie pozostałych plasterków.

Na jednym wkładzie membranowym można umieścić do pięciu przekrojów. Za pomocą pipety usuń nadmiar kompletnego roztworu HBSS. Następnie, przy pomocy pincety, ostrożnie umieść wkłady membranowe z przekrojami w płytce sześciościołowej zawierającej 1,8 mililitra pożywki do hodowli przekrojów.

Wybierz przekrój mózgu do obrazowania, oglądając preparaty pod mikroskopem odwróconym. Wybierz taki przekrój, w którym widoczne są jasne, pojedyncze neurony w górnej części SVZ, migrujące radialnie w kierunku powierzchni przekroju. Obecność cienkich, fluorescencyjnych wypustek komórek glejowe radialne, które przechodzą przez całą płytkę conjugate, świadczy o nienaruszonym rusztowaniu glejowym, z którego korzystają migrujące neurony conjugate.

Przenieś wkład membranowy z wybranym skrawkiem do szalki z szklanym dnem o średnicy 50 mm zawierającej 2 ml pożywki do hodowli skrawków. Umieść szalkę w komorze klimatycznej mikroskopu konfokalnego. Ustaw rozdzielczość na 512 na 512 pikseli.

Zwiększ szybkość skanowania z 400 hertz do 700 hertz, aby zwiększyć liczbę klatek z około 1,4 do około 2,5 klatek na sekundę. Użyj uśredniania nie więcej niż dwukrotnie. Zdefiniuj stos Z (Z-stack) przechodzący przez obszar poddany elektroporacji z rozmiarem kroku 1,5 microns.

Rozpocznij serię time-lapse, wykonując stos Z (Z-stack) co 30 minut. Opisane ustawienia zapewniają wystarczającą rozdzielczość i jasność obrazu, ograniczając jednocześnie fotouszkodzenia podczas akwizycji. Ten film przedstawia neurony korowe E16.5 migrujące z strefy podkomorowej do płytki korowej.

W transgenicznej linii warunkowej Bcl11a floxed po elektroporacji kontrolnego plazmidu IRES-GFP w 14,5 dniu embrionalnym. Film składa się ze 108 klatek przy prędkości pięciu klatek na sekundę. Pasek skali odpowiada 100 mikronom.

Elektroporacja plazmidowego wektora DNA zawierającego Cre-IRES-GFP wpłynęła na migrację neuronów korowych w warunkowych mózgach z Bcl11a floxed. Jak widać tutaj, bardzo niewiele neuronów przemieszcza się poza strefę pośrednią, aby dotrzeć do blaszki korowej. Ten film pokazuje polaryzację neuronów korowych z kontroli znakowanej GFP po lewej stronie w porównaniu z neuronami mutanta Bcl11a po prawej stronie.

Te animowane ślady reprezentatywnej kontroli w neuronach z mutacją Bcl11a zostały uzyskane z serii obrazów time-lapse kultur plastrów E16.5 z rozdzielczością czasową co jedną godzinę. Ponownie, dane z mózgu kontrolnego przedstawiono po lewej stronie, a dane z mózgu electroporowanego Cre-IRES-GFP po prawej stronie. Jak wynika z tego zbioru reprezentatywnych śladów z kontrolnych i zmutowanych kultur plastrów Bcl11a, neurony z mutacją Bcl11a często przechodzą powtarzające się fazy zmniejszonej prędkości migracji i losowo zmienionej orientacji, zaznaczone czerwonymi grotami strzałek.

Profile prędkości można obliczyć na podstawie ścieżek migrujących neuronów. Jak widać tutaj, większa proporcja neuronów z mutacją Bcl11a wykazuje wolniejszą prędkość migracji w porównaniu z grupą kontrolną. Kąt odchylenia można obliczyć z danych dotyczących ścieżek.

Jak widać na tym histogramie, neurony z mutacją Bcl11a, przedstawione przez czarne słupki, wykazują większe kąty odchylenia w porównaniu z grupą kontrolną. Po opanowaniu techniki, zarówno elektroporacja in utero, jak i przygotowanie organotypowych hodowli skrawków mózgu mogą zostać wykonane w czasie krótszym niż dwie godziny każda. Procedura ta może być łatwo dostosowana do analizy frakcyjnej wybranych genów w radialnie migrujących neuronach korowych poprzez zwiększenie lub zniesienie ich funkcji, a także do eksperymentów naczyniowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat bezpośredniej obserwacji neuronów migrujących radialnie w organotypowych kulturach skrawków przygotowanych z elektroporowanych mózgów embrionalnych przy użyciu konfokalnej mikroskopii poklatkowej.