Metody i wskazówki dotyczące dożylnego podawania szczurom wirusa związanego z adenowirusem oraz ocena transdukcji ośrodkowego układu nerwowego
25 sierpnia 2017
Omówiono metody dostarczania genów na szeroką skalę do ośrodkowego układu nerwowego u szczurów. W tym przykładzie celem jest naśladowanie choroby, która wpływa na cały rdzeń kręgowy. Rozległa transdukcja może być wykorzystana do dostarczenia białka terapeutycznego do OUN z jednorazowego podania obwodowego.
Ogólnym celem tego transferu genów za pomocą wektora wirusa towarzyszącego adenowirusom jest manipulacja genetyczna mózgu i rdzenia kręgowego szczura na szeroką skalę. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie transferu genów. Jest to bardzo wydajny sposób wprowadzania genów in-vivo, a tym samym technika niezwykle potężna i wszechstronna.
Procedura ta jest szybka i wysoce powtarzalna. W kilku publikacjach wykorzystaliśmy to szerokozakresowe podejście do transferu genów w celu ekspresji białka związanego z bocznym stwardnieniem zanikowym w całym rdzeniu kręgowym szczurów. Procedurę zaprezentuje mój kolega, Robert Dayton.
Mychal Grames będzie pomagać Robertowi. Należy rozpocząć od przygotowania stanowiska pracy; najpierw oczyścić powierzchnię 70% ethanol. Następnie umieścić matę grzewczą w obszarze roboczym i ustawić temperaturę na 37 degree celsius.
Umieść matę laboratoryjną na podkładce grzewczej. Sprawdź, czy ilość tlenu i izofluranu jest wystarczająca do przeprowadzenia procedury. Oczyść komorę indukcyjną i maskę anestezjologiczną 70% etanolem, a następnie połóż maskę anestezjologiczną na macie laboratoryjnej.
Należy przygotować następujące materiały: kwadrat folii parafinowej o wymiarach około 5 x 5 centymetrów na każde zwierzę, jeden alkoholowy wacik przygotowawczy oraz dwa lub trzy gaziki na każde zwierzę, końcówki do pipet oraz mikropipetę. Następnie rozmrozić wektor w temperaturze pokojowej i oznakować sterylną probówkę do mikrocentryfugi dla każdego zwierzęcia. Do odpowiedniej probówki nanieść pipetą wymaganą objętość AAV, a następnie uzupełnić objętość do pożądanego poziomu iniekcji za pomocą roztworu Ringera z mleczanem lub soli fizjologicznej.
Po wymieszaniu próbki w wstrząsarze wierzchołkowym przez jedną lub dwie sekundy, przeprowadź krótkie wirowanie przez pięć sekund, aby zebrać próbkę na dnie probówki. Odpipetuj całkowitą objętość do wstrzyknięcia z probówki na kwadrat folii parafinowej. Następnie załóż igłę o rozmiarze 30 G na strzykawkę o pojemności 1 ml.
Wprowadź igłę ściętą skierowaną w dół do wektora na folii parafinowej. Odciągnij tłok strzykawki, aż cały wirus znajdzie się w igle i strzykawce. Prawidłowo znieczul szczura, korzystając z systemu anestezji.
Upewnij się, że osiągnięto odpowiednią głębokość znieczulenia, sprawdzając brak reakcji na uciśnięcie palca u nogi. Następnie umieść szczura na boku w obszarze roboczym i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski nosowej. Przy szczurze leżącym na boku jedna z bocznych żył ogonowych powinna być skierowana do góry.
Iniekcję wykonuje się w dwóch trzecich długości ogona. Miejsce wstrzyknięcia należy przetrzeć gazikiem nasączonym alkoholem. Ogon należy mocno trzymać nieco powyżej miejsca iniekcji, kładąc jeden palec bezpośrednio nad boczną żyłą ogonową, co spowoduje rozszerzenie żyły.
Ustawiając ścięcie igły skierowane do góry, wyrównaj ją z widoczną żyłą ogonową w tym samym kierunku. Przebij skórę nad żyłą ogonową, zachowując szczególną ostrożność, aby nie nakłuć drugiej ręki trzymającej ogon i nie uciskać żyły ogonowej. Zwolnij ucisk z żyły ogonowej, aby umożliwić normalny przepływ krwi.
Następnie wprowadź igłę do żyły. Aby upewnić się, że igła przebiła żyłę ogonową, lekko cofnij tłok. Jeśli igła znajduje się w żyle, do jej wnętrza zacznie wpływać krew.
Po ewentualnej korekcie położenia igły, ustabilizuj ją, dociskając koniec strzykawki do ogona. Powoli wstrzyknij wektor do ogona z prędkością około 20 µL na sekundę. W przypadku nieprawidłowego wstrzyknięcia zwierzę zostanie jedynie częściowo transdukowane, a uzyskane wyniki prawdopodobnie nie będą użyteczne.
Jednakże przy odpowiedniej praktyce, prawidłowe iniekcje są bardzo powtarzalne i niezawodne. Po podaniu wektora należy wyjąć igłę z ogona i przez 30 do 60 sekund dociskać gazik do miejsca wstrzyknięcia, aby pomóc zahamować krwawienie. Wyłączyć znieczulenie izofluranem oraz dopływ tlenu.
Monitoruj szczura do momentu odzyskania przez niego przytomności, a następnie umieść go z powrotem w klatce. Materiały, które mogą być zanieczyszczone AAV, utylizuj w odpowiednim pojemniku na odpady biologiczne, a stanowisko pracy przemyj 70% etanolem. Z utrwalonego i krioprotektowanego mózgu zwierzęcia po iniekcji AAV pobierz koronalne skrawki o grubości 50 mikronów, korzystając z mikrotomu ślizgowego z platformą mrożącą.
Po przeprowadzeniu immunobarwienia na GFP i zamknięciu preparatów na szkiełkach, należy wykonać mikrofotografie każdego przekroju w zdefiniowanym obszarze zainteresowania, korzystając z mikroskopu z obiektywem o małym powiększeniu. Ustawienia kamery powinny pozostać niezmienne dla wszystkich analizowanych próbek, a dane należy zapisać w formacie plików TIFF. Następnie otwórz mikrofotografie w powszechnie dostępnym programie Scion Image.
Otworzą się dwa okna; zamknij okno oznaczone jako index color. Wybierz opcje, a następnie density slice. Zakres odcieni zostanie zaznaczony na czerwono w oknie tabeli wyszukiwania (look up table).
W oknie za pomocą kursora zaznacz wyłącznie specyficzne znakowanie GFP i przerwij czynność w momencie, gdy na obrazie zacznie pojawiać się niespecyficzne tło. Następnie kliknij analyze i ustaw skalę. W czwartej linii powinna znajdować się opcja units; z listy rozwijanej wybierz pixels, a następnie kliknij okay.
Aby zmierzyć obszar fluorescencyjny, należy kliknąć analyze, a następnie measure. Następnie należy kliknąć analyze i show results. Pojawi się okno z wynikami, a pomiar obszaru fluorescencyjnego będzie znajdować się pod nagłówkiem area.
Po zarejestrowaniu wszystkich pomiarów wyciągnij średnią z wartości uzyskanych z trzech do sześciu przekrojów na zwierzę. Użyj odpowiedniego testu statystycznego, aby porównać obszary transdukcji pomiędzy grupami. Ten reprezentatywny obraz przedstawia immunofluorescencję GFP w móżdżku szczura, cztery tygodnie po wstrzyknięciu AAV 9 GFP do żyły ogonowej.
Do selektywnego wyróżnienia obszaru fluorescencyjnego i kwantyfikacji wyróżnionych pikseli wykorzystano oprogramowanie do analizy obrazu. Jest to obraz GFP pochodzący od zwierzęcia nietransdukowanego. Analiza tego obrazu, z zastosowaniem tych samych parametrów co w przypadku zwierzęcia z wstrzykniętym GFP, wykazuje bardzo niski poziom sygnału tła.
Po opanowaniu metody, iniekcja może być wykonana w około pięciu minut na szczura. Podsumowując, technika ta opisuje sposób na efektywne wprowadzanie genów do OUN szczura; jednorazowe dostarczenie genu zapewnia trwałą ekspresję i długofalowe efekty. Co najważniejsze, manipulacja ośrodkowym układem nerwowym odbywa się obwodowo.
Stosunkowo nieinwazyjna dożylna iniekcja wektora dociera do mózgu i rdzenia kręgowego, czyli do OUN.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę szerokozakresowego dostarczania genów do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) u szczurów z wykorzystaniem wektora wirusa towarzyszącego adenowirusom. Technika ta ma na celu naśladowanie chorób atakujących rdzeń kręgowy i umożliwia dostarczenie białek terapeutycznych poprzez pojedynczą podaż obwodową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Terapia genowa
- Neurobiologia
- Tworzenie wektorów
Wprowadzenie
- Wektory wirusów towarzyszących adenowirusom są skuteczne w transferze genów in vivo.
- Dostarczanie genów może pomóc w zrozumieniu chorób neurologicznych.
- Wcześniejsze badania wykorzystywały tę metodę w różnych zastosowaniach.
- Technika ta jest znana z wysokiej wydajności i powtarzalności.
Cel badania
- W celu genetycznej manipulacji mózgiem i rdzeniem kręgowym szczura.
- Aby zbadać potencjał transferu genów w leczeniu chorób OUN.
- Aby zapewnić szybką i wszechstronną metodę wprowadzania genów.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie wektorów wirusów adeno-zależnych do transferu genów.
- Podanie obwodowe w celu uzyskania rozległej transdukcji.
- Zastosowanie metody w celu ekspresji białek związanych z chorobą.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez współpracownika.
Główne wyniki
- Pomyślna ekspresja białek związanych z bocianym stwardnieniem mięśniowym.
- Wykazana skuteczność dostarczania genów do rdzenia kręgowego.
- Walidacja metody w wielu publikacjach.
- Podkreślenie wszechstronności techniki transferu genów.
Wnioski
- Metoda ta jest potężnym narzędziem w badaniach nad ośrodkowym układem nerwowym.
- Dostarcza ona wiedzy na temat zastosowań terapii genowej.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć jej potencjał terapeutyczny.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia wydajną, szerokozakresową transdukcję ośrodkowego układu nerwowego u szczurów poprzez dożylne podanie AAV, co wspiera przedkliniczną walidację celów i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w modelach chorób neurodegeneracyjnych. Podejście to zapewnia powtarzalną, nieinwazyjną drogę do uzyskania szerokiej ekspresji transgenu w mózgu i rdzeniu kręgowym, ułatwiając weryfikację hipotez w neurogenetyce oraz badania nad dostarczaniem białek terapeutycznych. Znaczenie tej metody polega na przyspieszeniu przedklinicznych procesów badawczych poprzez zmniejszenie zmienności biologicznej i zwiększenie pewności prognostycznej w zakresie angażowania celów oraz modulacji szlaków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych dzięki szerokiej ekspresji transgenu w ośrodkowym układzie nerwowym w fizjologicznie istotnym modelu szczura.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu, umożliwiając trwałą ekspresję transgenu po jednorazowym podaniu obwodowym.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność dotyczącą celu poprzez wykazanie zależnej od dawki transdukcji w obrębie obszarów mózgu i rdzenia kręgowego.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje mierzalne odczyty ekspresji transgenu poprzez ilościowe oznaczenie fluorescencji GFP w określonych obszarach OUN.
- Powtarzalność: Zapewnia wysoce spójne poziomy transdukcji u różnych osobników, co umożliwia niezawodną standaryzację analizy.
- Skalowalność: Kompatybilna z badaniami na wielu zwierzętach dzięki szybkiej procedurze iniekcji (~5 minut na szczura) i minimalnej zmienności technicznej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Modelowanie chorób: Naśladuje rozległą patologię obserwowaną w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak ALS, poprzez transdukcję całego rdzenia kręgowego.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając długotrwałą ekspresję transgenu w celu oceny fenotypowej.
- Zgodność z biomarkerami: Wspiera ocenę dostarczania białek terapeutycznych oraz stopnia oddziaływania na cele w obrębie ośrodkowego układu nerwowego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając wczesne testowanie hipotez dotyczących celów terapeutycznych, skalowalny rozwój testów oraz podłużną ocenę fenotypową w systemach istotnych dla danej choroby.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez rozległą dostarczalność transgenów do OUN.
- Przesiewanie: Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe wyniki ekspresji transgenów do oceny związków lub konstruktów.
- Analityka: Umożliwia ilościowe określanie wydajności transdukcji w oparciu o fluorescencję przy użyciu narzędzi do analizy obrazu.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie rozległej patologii OUN oraz ekspresji białek terapeutycznych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do transferu genów celowanych w OUN dla wielu celów i modalności terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez umożliwienie spójnej, szerokozakresowej transdukcji OUN w celu walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i standaryzację dzięki szybkiemu, ściśle określonemu protokołowi wstrzykiwania dożylnego.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wiarygodnych przedklinicznych danych dotyczących transdukcji OUN.
- Wpływ na portfolio: Wspiera postępy w badaniach z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez walidację zaangażowania celu w istotnym dla choroby modelu szczura.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z gryzoniami, wykonywaniu wstrzykiwań dożylnych oraz stosowaniu technik aseptycznych.
- Zależy od dostępu do produkcji wektorów AAV, sprzętu do znieczulania oraz systemów obrazowania fluorescencyjnego.
- Wymaga standaryzacji między zespołami w zakresie objętości wstrzykiwanej dawki, miana wektora oraz okresów inkubacji po wstrzyknięciu.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów do różnych serotypów, promotorów i ładunków transgenów.
- Ograniczone przez potencjalne odpowiedzi immunologiczne na AAV oraz zmienną dostępność żyły ogonowej u poszczególnych zwierząt.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:58
Preparation for Injection
2:47
Vector Injection
4:55
Quantification of GFP Expression in the Cerebellum
7:30
Conclusion
6:48
Rapid Quantification of the GFP-positive Fluorescent Area in the Cerebellum After Intravenous AAV Administration to the Rat
0:05
Title
