Generowanie bibliotek sekwencjonowania immunoprecypitacji natywnej chromatyny do analizy gęstości nukleosomów
12 grudnia 2017
Prezentujemy zmodyfikowaną metodologię sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny natywnej (ChIP-seq) do generowania zestawów danych sekwencji odpowiednich dla struktury analitycznej gęstości nukleosomów ChIP-seq integrującej dostępność nukleazy mikrokokowej (MNazy) z pomiarami modyfikacji histonów.
Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie natywnych bibliotek sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny do analizy gęstości nukleosomów. Metoda ta może odpowiedzieć na pytania z zakresu epigenetyki, takie jak ujawnienie cech epigenomicznych w populacji komórek na poziomie pojedynczego nukleosomu i rozdzielenie heterogenicznych sygnatur chromatyny na ich ciągłe elementy. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie właściwości MNazy preferencyjnego dostępu do otwartego regionu chromatyny w celu wygenerowania pomiaru, który łączy dostępność MNazy z modyfikacją histonów.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ nie są w stanie uzyskać optymalnego trawienia MNazy. Rozpocznij ten protokół od przygotowania komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pierwszego dnia rozmrozić każdą komórkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 sekund.
Następnie przenieś komórki do lodu. Do każdej osadki komórkowej natychmiast dodaj lodowaty bufor do lizy one-X oraz jeden X do końcowego stężenia 10 000 komórek na 20 mikrolitrów. Wymieszaj 10 razy, pipetując w górę i w dół, nie tworząc pęcherzyków.
Pracując na lodzie, podwielokrotność 20 mikrolitrów na studzienkę powstałych lizatów na płytkę 96-dołkową. Przykryj płytkę plastikową uszczelką przed inkubacją na lodzie przez 20 minut. Oznacz płytkę jako MNaza i zapisz studzienki do klucza szablonu.
Tuż przed zakończeniem 20-minutowej lizy rozcieńczyć enzym MNazy jednym buforem rozcieńczającym MNazy do końcowego stężenia 20 jednostek na mikrolitr i trzymać go na lodzie. Pracując na lodzie, przygotuj główną mieszankę mineralizacji MNazy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie podwielokrotność 20 mikrolitrów mieszanki wzorcowej na każdy rząd próbek plus pięć mikrolitrów dodatkowej objętości do 96-dołkowej płytki zbiornika.
Po zakończeniu inkubacji lizatów wyjmij płytkę do wytrawiania MNazy z lodu. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 20 mikrolitrów MNnaza jedną główną mieszankę mineralizacyjną do każdego rzędu próbek i wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy. Zmieniaj końcówki między rzędami.
Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej dokładnie przez pięć minut. Aby zatrzymać reakcję po pięciu minutach, użyj wielokanałowej pipety, aby dodać sześć mikrolitrów 250-mikromolowego EDTA do każdego rzędu próbek i kilkakrotnie wymieszać w górę iw dół. Pamiętaj, aby zmieniać końcówki między rzędami.
Po dodaniu EDTA zmień ustawienie pipety na 20 mikrolitrów i wymieszaj 10 razy jak poprzednio, aby zapewnić całkowite zatrzymanie reakcji trawienia. Na koniec dodaj sześć mikrolitrów 10-krotnego buforu do lizy do każdego rzędu próbek trawionych przez MNazę i dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół 10 razy. Przykryj płytkę plastikową uszczelką i inkubuj na lodzie przez 15 minut.
Przygotować płytkę z kompleksem kulek przeciwciał i płytkę do wstępnego oczyszczania, jak opisano w protokole tekstowym. Szybko odwiruj obie płytki, wirując przez 10 sekund w temperaturze 200 razy G. Następnie umieść złożoną płytkę z kulkami przeciwciała na magnesie płytkowym i odczekaj 15 sekund, aż roztwór stanie się klarowny. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety, nie naruszając kulek.
Następnie zdejmij płytkę z płyty magnetycznej i trzymaj ją na lodzie. Umieść płytkę reakcyjną do wstępnego czyszczenia na płycie magnetycznej i odczekaj 15 sekund, aż kulki się oddzielą, a roztwór stanie się klarowny. Nie naruszając kulek, za pomocą pipety ostrożnie przenieść supernatant do odpowiednich dołków na płytce z kompleksem kulek przeciwciała trzymanej na lodzie.
Delikatnie wymieszaj każdą studzienkę, pipetując w górę i w dół 15 razy. Dobrze uszczelnij płytkę aluminiową pokrywą płyty i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na obrotowej platformie. Po inkubacji ponownie oznaczyć płytkę IP Reaction.
Drugiego dnia ustaw mikser grzewczy na 65 stopni Celsjusza, a następnie przygotuj na lodzie bufor do płukania o niskiej zawartości soli i bufor do płukania o wysokiej zawartości soli. Szybko obracaj płytkę reakcyjną IP przez 10 sekund z prędkością 200 razy G. Umieść płytkę reakcyjną IP na płycie magnetycznej i odczekaj 15 sekund, aż roztwór stanie się klarowny. Za pomocą pipety wielokanałowej, nie naruszając kulek, ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant.
Zdejmij płytkę z płyty magnetycznej i umieść ją na lodzie. Do każdego rzędu próbek na płytce reakcyjnej IP dodać 150 mikrolitrów lodowatego buforu do płukania o niskiej zawartości soli i powoli mieszać w górę iw dół przez 10 razy, aby całkowicie zawiesić kulki. Umieść płytkę reakcyjną IP z powrotem na płycie magnetycznej i usuń supernatant jak poprzednio.
Następnie umieść talerz z powrotem na lodzie i powtórz kroki mycia, w sumie dwa prania. Pracując na lodzie, dodać 150 mikrolitrów buforu do płukania o wysokiej zawartości soli do każdego rzędu próbek na płytce reakcyjnej IP. Próbki należy mieszać powoli, pipetując 10 razy w górę i w dół, aby całkowicie zawiesić kulki.
Po usunięciu supernatantu, jak poprzednio, umieścić płytkę reakcyjną IP na lodzie i wstępnie schłodzić nową 96-dołkową płytkę obok niej. Do każdego rzędu próbek na płytce reakcyjnej IP dodać 150 mikrolitrów buforu do płukania o wysokiej zawartości soli i powoli mieszać 10 razy, pipetując w górę iw dół, aby całkowicie zawiesić kulki. Po ponownym zawieszeniu przenieść każdy rząd próbek do odpowiedniego rzędu nowej, wstępnie schłodzonej płytki 96-dołkowej.
Wyrzuć starą płytę. Umieść nową płytkę reakcyjną IP na płycie magnetycznej i wyrzuć supernatant jak poprzednio. Utrzymuj talerz w temperaturze pokojowej.
Do każdego rzędu próbek na płytce reakcyjnej IP dodać 30 mikrolitrów buforu elucyjnego ChIP i powoli mieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy. Uważaj, aby nie dopuścić do tworzenia się pęcherzyków. Uszczelnij płytkę pokrywką PCR i inkubuj w mieszalniku grzewczym w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 1 1/2 godziny z prędkością mieszania 1 350 obr./min.
Po 1 1/2-godzinnej inkubacji obracać płytkę reakcyjną IP pod ciśnieniem 200 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umieść płytkę reakcyjną IP na płycie magnetycznej i poczekaj, aż roztwór się usunie. Za pomocą pipety wielokanałowej, nie naruszając kulek, ostrożnie przenieś 20 mikrolitrów supernatantu na nową 96-dołkową płytkę, używając świeżych końcówek dla każdego rzędu.
Oznacz płytkę IP Reaction i przechowuj ją w temperaturze pokojowej. Przystąp do trawienia białek, a następnie budowy biblioteki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki optymalnej, niedostatecznie strawionej i nadmiernie strawionej chromatyny trawionej przez MNazę przed wygenerowaniem biblioteki.
Optymalnie trawiony profil jest zdominowany przez pojedyncze rozmiary fragmentów nukleosomów, ale nie jest nadmiernie trawiony, aby umożliwić odzyskanie fragmentów nukleosomów wyższego rzędu. Nieoptymalne trawienie chromatyny będzie również widoczne w profilu biblioteki sekwencjonowania wygenerowanej z materiału IP. Aby zweryfikować biblioteki za pomocą qPCR, oceniono wzbogacanie bibliotek IP w krotny sposób w odniesieniu do biblioteki wejściowej pod kątem celów pozytywnych i ujemnych.
Ponadto inspekcja wyrównanych odczytów bibliotek ze wzbogaceniem fałdowym ocenianym za pomocą wysokiej jakości qPCR w przeglądarce genomu powinna ujawnić wizualnie wykrywalne wzbogacenia w porównaniu z biblioteką wejściową. Udane biblioteki sekwencjonowania ChIP o gęstości nukleosomów będą zawierać wysoce skorelowane powtórzenia ze znaczną częścią wyrównanych odczytów w obrębie wzbogaconych pików zidentyfikowanych przez MACS2. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować natywne biblioteki sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny do analizy gęstości nukleosomów. Próbując tej procedury, należy pamiętać, aby upewnić się, że chromatyna jest optymalnie trawiona i używać tylko przeciwciał, które wykazują wysokie powinowactwo do epitopu będącego przedmiotem zainteresowania i wykazują niewielką lub żadną reaktywność krzyżową z innymi epitopami. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić modelowanie obliczeniowe dostępności MNazy, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak sygnatury epigenetyczne wynikające z heterogeniczności w populacji komórek.
Metoda ta zapewnia wgląd w kombinatoryczny efekt położenia nukleosomów i gęstości lokalnej, a także potranslacyjną modyfikację ich podjednostek histonów i może być stosowana do dowolnych układów, takich jak komórki ludzkie lub mysie, komórki pierwotne i zamrożone tkanki.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zmodyfikowaną metodologię natywnego sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP-seq), mającą na celu wygenerowanie zbiorów danych sekwencyjnych do analizy gęstości nukleosomów. Metoda ta integruje dostępność nukleazy mikrokokkowej (MNase) z pomiarami modyfikacji histonów, dostarczając informacji o cechach epigenetycznych na poziomie pojedynczego nukleosomu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Epigenetyka
- Biologia chromatyny
- Sekwencjonowanie genomowe
Wprowadzenie
- Natywne ChIP-seq jest kluczowe dla badania struktury i funkcji chromatyny.
- Zrozumienie gęstości nukleosomów jest istotne dla analiz epigenomicznych.
- MNaza preferencyjnie trawi otwartą chromatynę, co wspomaga badanie modyfikacji histonów.
- Istnieją trudności w osiągnięciu optymalnego trawienia przez MNazę w celu uzyskania dokładnych wyników.
Cel badania
- Opracowanie udoskonaleonego protokołu ChIP-seq do analizy gęstości nukleosomów.
- Połączenie dostępności dla MNase z pomiarami modyfikacji histonów.
- Ułatwienie rozdzielczości heterogenicznych sygnatur chromatyny.
Zastosowane metody
- Przygotowanie i lizaza komórek z użyciem schłodzonych buforów.
- Trawienie MNazą w celu oceny dostępności chromatyny.
- Immunoprecypitacja chromatyny z wykorzystaniem kompleksów przeciwciał i kulek.
- Konstrukcja bibliotek do analizy sekwencyjnej.
Główne wyniki
- Skuteczne generowanie bibliotek ChIP-seq do analizy gęstości nukleosomów.
- Integracja danych o dostępności MNase z profilami modyfikacji histonowych.
- Zwiększona rozdzielczość sygnatur chromatyny na poziomie nukleosomów.
- Optymalizacja protokołu w celu poprawy wyników trawienia MNase.
Wnioski
- Zmodyfikowana metodologia ChIP-seq dostarcza cennych informacji na temat dynamiki chromatyny.
- Podejście to może znacząco przyczynić się do lepszego zrozumienia regulacji epigenetycznej.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować szersze badania nad zjawiskami związanymi z chromatyną.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Sekwencjonowanie immunoprecypitacji natywnej chromatyny (ndChIP-seq) umożliwia mapowanie z wysoką rozdzielczością gęstości nukleosomów oraz modyfikacji histonów w rzadkich lub pierwotnych populacjach komórek. Ten kombinacyjny pomiar zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów epigenetycznych oraz w minimalizacji ryzyka mechanistycznego na wczesnych etapach odkryć. Podejście to wspiera decyzje dotyczące portfela projektów poprzez wyjaśnienie regulacyjnych mechanizmów zależnych od chromatyny, które mają znaczenie dla kontroli transkrypcyjnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie stanu chromatyny i modyfikacji histonów z rozdzielczością pojedynczego nukleosomu.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez przekształcanie heterogenicznych sygnatur chromatyny w elementy ciągłe.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów w rzadkich systemach komórkowych lub komórkach pierwotnych, które są niedostępne dla metody cross-linking ChIP-seq.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do hipotez dotyczących regulacji transkrypcyjnej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane profile chromatyny dla dalszych etapów analizy przesiewowej w badaniach epigenetycznych.
- Standaryzuje trawienie MNazą oraz immunoprecypitację w celu uzyskania powtarzalnych, ilościowych wyników.
- Umożliwia opracowanie solidnych testów w zakresie modyfikacji histonów i dostępności nukleosomów.
- Wspiera wiarygodną ocenę związków ukierunkowanych na modyfikatory chromatyny.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje pomiary stanu chromatyny z biomarkerami transkrypcyjnymi istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną w próbkach tkanek pierwotnych lub mrożonych.
- Minimalizuje ryzyko decyzji o dalszym rozwoju badań poprzez wyjaśnienie mechanizmów epigenetycznych w modelach translacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
ndChIP-seq wpisuje się w proces od odkrycia do fazy przedklinicznej, umożliwiając wysokorozdzielczą analizę chromatyny w systemach, w których tradycyjne ChIP-seq z sieciowaniem jest niepraktyczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących regulacji chromatyny i kontroli transkrypcyjnej.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe dane dotyczące nukleosomów i modyfikacji histonów w celu przygotowania testów.
- Analityka: Zapewnia pomiary w skali całego genomu oraz wyniki statystycznego wzbogacenia do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Rozszerza możliwość zastosowania na komórki pierwotne i tkanki mrożone w celu dopasowania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje powtarzalny schemat postępowania dla różnych typów komórek i źródeł próbek.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów epigenetycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje profilowanie chromatyny w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w ramach projektów.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie portfelem pod kątem kapitałowym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez wyjaśnienie mechanizmów regulacyjnych zależnych od chromatyny.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu biologii chromatyny oraz technik immunoprecypitacji.
- Konieczny jest dostęp do trawienia nukleazą MNase, sekwencjonowania wysokoprzepustowego oraz infrastruktury do analizy obliczeniowej.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów trawienia i walidacji przeciwciał pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do zastosowania w różnych systemach modelowych, w tym w przypadku tkanek ludzkich, mysich oraz mrożonych.
- Kluczowe dla uzyskania wiarygodnych wyników są optymalne trawienie przez MNase oraz specyficzność przeciwciał.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:51
Cell Lysis and Chromatin Digestion for Nucleosome Density ChIP-se
3:21
Immunprecipitation Reaction for Nucleosome Density ChIP-seq
4:33
Washes and Elution for Nucleosome Density ChIP-seq
7:31
Results: Evaluation of Nucleosome Density ChIP-seq Libraries
8:50
Conclusion
