Stereotaktyczne przechwytywanie laserowe pod kontrolą atlasu Mikrodysekcja obszarów mózgu dotkniętych urazem urazowym
11 września 2017
Opisujemy użycie mikrodysekcji laserowej do uzyskania próbek różnych populacji komórek z różnych regionów mózgu do analizy genów i mikroRNA. Technika ta pozwala na badanie zróżnicowanych skutków urazowego uszkodzenia mózgu w określonych obszarach mózgu szczura.
Ogólnym celem niniejszego protokołu mikrodysekcji sterowanej laserem jest pobranie komórek ze specyficznych obszarów mózgu dotkniętych urazowym uszkodzeniem mózgu w celu przeprowadzenia analizy molekularnej. Jestem doktor Helen Hellmich. Mój asystent, Harris Weisz, student programu Patofizjologii Człowieka i Medycyny Translacyjnej tutaj, w oddziale medycznym University of Texas, zademonstruje, w jaki sposób wykorzystujemy metody mikrodysekcji sterowanej laserem w naszych badaniach nad urazami mózgu.
Ta metoda może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów i konsekwencji zmian wywołanych przez TBI w określonych obszarach mózgu, takich jak kora przedczołowa, która kontroluje funkcje wykonawcze, oraz hipokamp, który jest istotny dla procesów zależnych od pamięci. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania wpływu procesu chorobowego na wiele oddzielnych obszarów mózgu lub poszczególne typy komórek z tego samego mózgu.
Przed każdą procedurą LCM obejmującą analizę transkrypcyjną, należy oczyścić wszystkie powierzchnie detergentem eliminującym RNazy, aby zminimalizować ryzyko kontaminacji i degradacji RNA. Wyjąć tkankę mózgową z miejsca przechowywania i umieścić w kriosztacie schłodzonym do -20 °C.
Pozostawić mózg do wyrównania temperatury z komorą kriostatu przez około dziesięć minut. Umieścić mózg stroną brzuszną do góry na arkuszu gazy na stole kriostatu. Za pomocą czystego ostrza do RNA odciąć część tylną tuż przed móżdżkiem oraz część znajdującą się przed skrzyżowaniem wzrokowym.
Umieść niewielką ilość medium do kriostatu (OCT) w dwóch oddzielnych formach do mrożenia. Umieść mózg zawierający korę przedczołową oraz jądro treści we jednej formie, stroną wewnętrzną skierowaną w dół. Dodaj wystarczającą ilość medium OCT, aby całkowicie pokryć tkankę.
Powtórz ten krok z fragmentem tkanki mózgowej zawierającym hipokamp i jądro nadskrzyżowaniowe. Pozostaw medium OCT do całkowitego zamrożenia na około 20 minut w kriotomie. Gdy tkanka i medium OCT zostaną całkowicie zamrożone, wyciśnij niewielką ilość OTC na głowicę montażową.
Dociśnij zamrożoną formę kriogeniczną do głowicy montażowej i poczekaj, aż OCT całkowicie zamarznie, tak aby forma zawierająca tkankę była bezpiecznie przymocowana do głowicy. Przymocuj głowicę do uchwytu sekcyjnego i dokręć śrubę. Za pomocą dźwigni regulacyjnych ustaw kąt cięcia względem noża kriotoma, aby zapewnić równomierne wycinanie sekcji.
Ustaw grubość przekroju na 30 mikronów. Podczas wykonywania przekrojów bloku tkanki zawierającego hipokamp i SEN, prowadź sekcjonowanie aż do momentu spłaszczenia skrzyżowania nerwów wzrokowych przy bregmie 0,48 milimetrów, kiedy widoczny stanie się trzeci komora mózgu. Następnie zbieraj przekroje do SEM od tego punktu, delikatnie układając na wierzchu pociętej tkanki szkiełka z błoną z polietylo-naftalenu w temperaturze pokojowej.
Wizualnie upewnij się, że preparat przylega do szkiełka, potwierdzając, że tkanka i OTC całkowicie stopiły się na jego powierzchni. Przechowuj wszystkie szkiełka z sekcjami tkankowymi w kriostacie do momentu barwienia. Zaprzestań pobierania sekcji na poziomie bregma 0,72 milimetrów, gdy rozpocznie się dekusacja nadwzrokowa.
W celu pobrania hipokampa należy wykonywać przekroje, aż do momentu, gdy rogi warstwy ziarnistej zakrętu zębatego staną się widoczne na poziomie 3,00 mm bregmy. Przekroje należy pobierać do czasu, aż podpola CA hipokampa zleją się w przekrojach czołowych na poziomie 4,78 mm bregmy. Pozwala to na całkowite pobranie hipokampa spod miejsca kraniotomii i urazu.
Przed barwieniem należy umyć wszystkie naczynia oraz obszar barwienia w dygestorium chemicznym przy użyciu detergentu usuwającego RNazy. Wyjąć kasetę ze szkiełkami z kriostatu i umieścić ją w dygestorium. Pozostawić szkiełka do ogrzania przez 30 sekund.
Zabarw skrawki fioletem krezylowym i oczyść solą fizjologiczną. Pozostaw statyw z zabarwionymi slajdami do wyschnięcia na powietrzu przez nie więcej niż dziesięć minut w temperaturze pokojowej w dygestorium. Po wyschnięciu niezwłocznie przystąp do LCM.
Przed rozpoczęciem jakiejkolwiek procedury LCM do analizy RNA należy przetrzeć obszar pobierania oraz okolicę urządzenia detergentem eliminującym RNazy i 100% ethanol. Przed włączeniem podstawy mikroskopu należy przełączyć przełącznik zasilania w jednostce generującej laser podczerwony i poczekać na zainicjowanie systemu przed uruchomieniem oprogramowania z pulpitu. Po uruchomieniu oprogramowania i przejściu przez etapy inicjalizacji należy otworzyć panel konfiguracji oprogramowania i nacisnąć przycisk „present stage”.
Modułowy stolik przesunie się do pozycji, w której można załadować i wyładować nakrętki makro oraz szkiełka LCM. Umieść do trzech szkiełek z membraną w uchwytach, tak aby matowa krawędź była skierowana w prawo. Wybierz obszar obsługi nakrętek i szkiełek obok odpowiedniego szkiełka i zaznacz pole wyboru MEM, aby poinformować oprogramowanie, że załadowano szkiełka szklane z membraną.
Następnie kliknij wybrany preparat, który ma zostać przeanalizowany jako pierwszy. Aby uzyskać obraz mozaikowy w celu ustalenia lokalizacji i orientacji tkanki pod kątem rozmieszczenia nakładek, wybierz opcję image na pasku narzędzi, a następnie wybierz acquire overview. Umieść kursor nad obszarem na obrazie mozaikowym, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz place cap at region center.
Oprogramowanie automatycznie nałoży nakładkę na wybraną pozycję. Po zlokalizowaniu laserów podczerwonych i UV należy wybrać opcję rysowania ręcznego w panelu narzędzi wyboru. Używając rysika ekranu dotykowego, obrysuj obwód obszaru zainteresowania, dbając o to, aby nie przerwać kontaktu między ekranem dotykowym a końcówką rysika.
Należy upewnić się, że punkty początkowy i końcowy są ze sobą połączone. W przypadku pobierania materiału z hipokampa, przeprowadź laserową mikrodysekcję (LCM) podpól CA1, CA2 i CA3 hipokampa, zaczynając od poziomu 3,00 mm względem bregmy i wykorzystując w pełni uformowaną warstwę ziarnistą zakrętu zębatego jako fizyczny punkt orientacyjny do identyfikacji morfologicznej. Po zakończeniu pobierania przesuń nakładki makro LCM do pozycji QC i sprawdź, czy tkanka przylega całkowicie, wizualnie upewniając się, że wycięta promieniami UV tkanka jest przytwierdzona do membrany.
Niezbędne jest, aby laser UV wyciął obszar wokół całej tkanki. Niedopełnienie tego warunku spowoduje niepełne przyleganie tkanki do nakładki LCM. Następnie szybko umieść każdą nakładkę w wolnej od RNaz probówce reakcyjnej o cienkich ściankach o pojemności 0,5 mililitra, zawierającej 100 microliters buforu do lizy komórek.
Próbki należy krótko wymieszać w wortexie, aby zapewnić całkowitą lizę, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia dalszych analiz genomicznych. Poniżej przedstawiono reprezentatywne obrazy przekrojów tkanki pobranych z obszaru przeciwległego do miejsca urazu z wykorzystaniem funkcji laserowych podczerwonych i UV w systemie LCM. Jest to obszar przedczołowej kory asocjacyjnej.
Na tym obrazie przedstawiono ten sam obszar po pobraniu próbek. Tutaj widoczna jest tkanka na zakrętce po pobraniu. Obraz ten pokazuje komponenty warstw okołorogowych CA1, CA2 i CA3 hipokampa, zlokalizowane obok w pełni uformowanych rogów warstwy ziarnistej zakrętu zębatego.
Zebrano regiony CA2 i CA3, a populacje tych komórek są widoczne na nakładce. Tutaj obszar jądra półleżącego (nucleus accumbens core) położony proksymalnie i adrostralnie względem komisury przedniej został celowo wybrany i wiernie odwzorowany na nakładce. Na koniec, za pomocą LCM, po TBI pobrano jądro nadskrzyżowaniowe położone rostralnie względem skrzyżowania nadwzrokowego.
Po opanowaniu tej techniki można przetworzyć jeden mózg w ciągu około ośmiu godzin. Czas ten obejmuje obróbkę tkanki, barwienie oraz LCM. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza epigenetyczna, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące wzorców metylacji lub ekspresji mikronowej.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić LCM w wielu obszarach mózgu w obrębie tego samego organu.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje zastosowanie laserowej mikrodysekcji (LCM) w celu pozyskania specyficznych populacji komórek z różnych obszarów mózgu szczura do analizy ekspresji genów i mikroRNA. Technika ta pozwala na lepsze zrozumienie zróżnicowanego wpływu urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) na poszczególne regiony, takie jak kora czołowa i hipokamp.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Analiza molekularna
Wstęp
- TBI może wywoływać zróżnicowane efekty w różnych obszarach mózgu.
- Zrozumienie tych efektów na poziomie komórkowym wymaga zastosowania precyzyjnych technik pobierania próbek.
- LCM umożliwia ukierunkowaną analizę konkretnych typów komórek bez zanieczyszczeń.
- Badanie to niesie ze sobą zarówno praktyczne, jak i metodologiczne implikacje dla badań z zakresu neuronauki.
Cel badania
- Wykorzystanie LCM do izolacji komórek mózgu dotkniętych TBI.
- Analiza ekspresji genów i mikroRNA istotnych dla TBI.
- Wyjaśnienie molekularnych następstw TBI w wybranych obszarach mózgu.
Zastosowane metody
- Podstawową wykorzystaną platformą jest laserowa mikrosekcja wycinająca (LCM).
- Model biologiczny obejmuje tkanki mózgu szczura, ze szczególnym uwzględnieniem obszarów dotkniętych TBI.
- Badanie określa krytyczne ramy czasowe dla przygotowania tkanek, ich sekcjonowania oraz barwienia.
- W całym protokole kładziony jest nacisk na staranne kroki zapobiegające kontaminacji.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja docelowych populacji komórek z obszarów takich jak kora czołowa i hipokamp.
- Wgląd w zmiany indukowane przez TBI na poziomie molekularnym, stanowiący podstawę dla przyszłych badań mechanistycznych.
- Zidentyfikowanie krytycznych etapów sekcjonowania i barwienia w celu niezawodnego pobrania RNA.
Wnioski
- Badanie wykazuje, w jaki sposób LCM może ułatwić ukierunkowane analizy molekularne skutków TBI.
- Wnioski obejmują lepsze zrozumienie mechanizmów neuronalnych dotkniętych urazem.
- Metoda ta zwiększa precyzję w badaniach nad neuronauką i otwiera możliwości poszukiwań terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Mikrosekcyjna analiza laserowa (LCM) umożliwia precyzyjne profilowanie molekularne poszczególnych obszarów mózgu dotkniętych urazowym uszkodzeniem mózgu (TBI), wspierając walidację celów poprzez analizę ekspresji genów i mikroRNA w rozdzielczości przestrzennej. Podejście to redukuje zakłócenia sygnałów pochodzące z heterogenicznych tkanek, zwiększając pewność prognostyczną w procesie ograniczania ryzyka mechanistycznego w badaniach nad szlakami TBI. Poprzez izolację odpowiedzi specyficznych dla danego regionu z tego samego zwierzęcia, LCM poprawia ciągłość translacyjną oraz efektywność selekcji projektów w badaniach neurobiologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację obszarów dotkniętych TBI, takich jak kora czołowa i hipokamp, w celu wyjaśnienia szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia biologicznie zoptymalizowaną walidację celów terapeutycznych dzięki analizie molekularnej z rozdzielczością przestrzenną, bez artefaktów wynikających z dysocjacji tkanki.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez powiązanie regionowych zmian w ekspresji genów z wynikami funkcjonalnymi w procesach wykonawczych i pamięciowych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych analiz genomicznych poprzez zachowanie integralności przestrzennej i naturalnego rozmieszczenia obszarów mózgu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność analiz dzięki sekcjonowaniu prowadzonemu przez punkty orientacyjne anatomiczne z wykorzystaniem atlasu mózgu szczura.
- Wartość skalowalności: Umożliwia wiarygodną ocenę związków poprzez dostarczenie ilościowych, specyficznych dla regionu odczytów molekularnych z poszczególnych obszarów mózgu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Zachowuje istotność w kontekście choroby, umożliwiając analizę zmian w ekspresji genów i mikroRNA indukowanych przez TBI w anatomicznie zdefiniowanych obszarach mózgu.
- Ciągłość przedkliniczna: Wspiera decyzje dotyczące rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, umożliwiając podłużne profilowanie molekularne od etapu odkryć po etapy przedkliniczne.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Koncentruje się na wartości prognostycznej poprzez izolację przyczynowych zmian molekularnych w konkretnych regionach, a nie na średnich wartościach dla całej tkanki.
Integracja potoku i przepływu pracy
LCM wpisuje się w kontinuum odkryć, od identyfikacji celu, poprzez optymalizację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną, umożliwiając analizę mechanizmów TBI opartą na hipotezach w kluczowych obszarach mózgu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez izolację specyficznych populacji komórek z obszarów dotkniętych urazami, takich jak jądro półleżące (nucleus accumbens core) oraz jądro nadskrzyżowaniowe (suprachiasmatic nucleus).
- Przesiew: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu cięciu w określonych współrzędnych bregma oraz przetwarzaniu w warunkach wolnych od RNaz w celu uzyskania wiarygodnej wydajności RNA.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów zmiennych zależnych, w tym profilów ekspresji genów i mikroRNA z tkanki pobranej za pomocą mikrodysekcji laserowej.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z pracami przedklinicznymi, umożliwiając analizę epigenetyczną i metylacyjną po przeprowadzeniu LCM, zgodnie z opisem w protokole.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi wielokrotnie wykorzystywalną metodę w różnych modelach chorób, której zasady można zastosować w badaniach nad ekspresją genomiczną w innych kontekstach urazów lub chorób.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej poprzez walidację celów oraz redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w analizie szlaków TBI.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki zastosowaniu sekcji w kriotomie, prowadzenia według atlasu oraz przepływów pracy z kontrolą aktywności RNazy.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach poprzez izolację specyficznych dla regionu odpowiedzi molekularnych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja dostosowana do ryzyka oraz decyzje o dalszym rozwoju oparte na dopasowaniu biomarkerów rozdzielonych przestrzennie.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu neuroanatomii, sekcjonowania w kriosztacie oraz obsługi instrumentarium do laserowej mikrodysekcji uchwytowej.
- Konieczne jest zapewnienie środowiska wolnego od RNaz, kriosztatu w temperaturze -20°C, optymalnego medium do cięcia (OCT) oraz systemów laserowych UV/IR.
- Wymagana jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów barwienia, zbierania sekcji i ładowania kapturek pomiędzy zespołami neurobiologii i biologii molekularnej.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dostosowanie współrzędnych sekcjonowania względem bregmy dla różnych obszarów mózgu i modeli zwierzęcych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność rygorystycznej kontroli zanieczyszczeń oraz biegłość techniczną w prowadzeniu śladu laserem UV w celu zapewnienia pełnego przylegania tkanki.
