Indukcja paraliżu i uszkodzenia układu wzrokowego u myszy przez limfocyty T specyficzne dla Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wywołanie autoimmunologicznej choroby ośrodkowego układu nerwowego (OUN) poprzez adoptywny transfer limfocytów T specyficznych dla akwaporyny 4 oraz monitorowanie wynikających z tego efektów w OUN i dynamicznym systemie wizualnym. Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli limfocytów T specyficznych dla akwaporyny 4, powszechnie znanej jako AQP4, w neuromyelitis optica, a także w innych zapalnych schorzeniach wzroku. Główną zaletą optycznej koherentnej tomografii jest możliwość nienapastliwego, podłużnego monitorowania uszkodzeń siatkówki.

Procedurę zaprezentują Sharon Sagan, pracownik naukowy w moim laboratorium, oraz Andreas Cruz Harans, stażysta w laboratorium RE Greens. W pierwszej kolejności należy przymocować trójdrożny nylonowy kranik z dwoma męskimi złączami Luer lock do szklanej strzykawki z złączem Luer lock, pozbawionej tłoka. Przełączyć dźwignię kranika w stronę strzykawki, aby go zamknąć, a następnie ustawić strzykawkę otwartym końcem do góry.

Po wymieszaniu w wstrząsarce wirowej, do strzykawki należy dodać równe objętości peptydy oraz roztworu pełnego adiuwanta Freunda, a następnie ponownie włożyć szklany tłok do strzykawki. Przytrzymując tłok w miejscu, należy odwrócić strzykawkę tak, aby kurek znajdował się u góry, i przełączyć dźwignię na nieużywane przyłącze żeńskie. Należy ostrożnie nacisnąć tłok, aby usunąć nadmiar powietrza ze strzykawki.

Roztwór wypełni drugie męskie przyłącze Luer lock kurka. Następnie należy podłączyć drugą szklaną strzykawkę z całkowicie wsuniętym tłokiem do drugiego męskiego przyłącza Luer lock. Aby stworzyć emulsję, należy naprzemiennie naciskać tłoki, przepuszczając roztwór między dwiema strzykawkami przez około dwie minuty, a następnie chłodzić roztwór przez około 10 minut, aż do momentu zauważalnej zmiany lepkości roztworu.

Gdy powstanie bardzo gęsta biała emulsja, przenieść cały roztwór do jednej z strzykawek, a pustą strzykawkę zastąpić nową strzykawką 1 mm z końcówką Luer lock. Napełnić nową strzykawkę emulsją. Zdjąć strzykawkę z kurka i przymocować igłę 25G.

Aby sprawdzić konsystencję emulsji w wodzie, należy wycisnąć kroplę emulsji do niewielkiego naczynia z wodą. Jeśli emulsja nie rozproszy się, nadaje się ona do wstrzyknięcia. Następnie każdego myszego donora z knockoutem AQP4 należy zaszczepić podskórnie jednorazowo po jednej stronie dolnej części brzucha oraz po jednej stronie klatki piersiowej, przyśrodkowo w obrębie pachy.

Od 10 do 12 dni po immunizacji wykonaj nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej od pachwiny do szyi oraz wzdłuż każdej kończyny tylnej pierwszej myszy. Odciągnij skórę od otrzewnej i mocno przymocuj ją do podkładki. Następnie pobierz węzły chłonne pachwinowe i pachowe, a następnie umieść tkanki w sitku do komórek w szalce Petriego zawierającej pożywkę kompletną.

Po zebraniu wszystkich węzłów chłonnych umieścić sitko do komórek na probówce stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej świeżą pożywkę kompletną w lodzie, a następnie za pomocą płaskiego końca tłoka sterylnej strzykawki 5-mililitrowej przecisnąć komórki z węzłów chłonnych przez siatkę filtra. Przepłukać siatkę od 20 do 30 ml pożywki kompletnej, aby ułatwić odzysk komórek, a następnie przeprowadzić dwa przemycia poprzez wirowanie. Po drugim wirowaniu zawiesić osad w pożywce dla limfocytów T w celu dokonania odliczenia komórek.

Do komórek dodać odpowiednie stężenia antygenu, rekombinowanej mysiej interleukiny 23 oraz rekombinowanego mysiego IL-6, a następnie do każdej studzienki płytki 12-dołkowej nanieść po dwa mililitry komórek w tej mieszaninie polaryzującej Th17. Następnie płytkę umieścić w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5%CO2 na 72 godziny. Trzeciego dnia polaryzacji hodowle w każdej studni kilka razy triturować, aby oderwać spolaryzowane komórki, a następnie zebrać je do probówki stożkowej o pojemności 50 ml w temperaturze 0 °C w celu ich przeliczenia.

Po dwukrotnym przemyciu w PBS, rozcieńcz komórki w PBS do stężenia 1 × 10⁸ komórek/ml i delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową, obracając naczynie. W ciągu godziny od ich zebrania przenieś komórki do strzykawki o pojemności 1 ml i podaj 200 µL komórek dożylnie przez żyłę ogonową każdemu zwierzęciu biorcy. Następnie wstrzyknij każdej myszy dootrzewnowo natychmiast oraz dwa dni później 200 ng toksyny B krztuśca rozcieńczonej w 200 µL PBS.

W celu obrazowania siatkówki zwierząt biorców in vivo za pomocą optycznej koherentnej tomografii, na pięć minut przed badaniem należy rozszerzyć źrenice, podając jedną kroplę 1% tropikamidu do każdego oka, a następnie włączyć matę grzewczą. Umieść mysz na cylindrze do obrazowania i odpowiednio przekieruj przepływ anestetyka. Oczy należy zabezpieczyć 0,3% hydroksypropylometylocelulozą, aby zachować ich wilgotność oraz zapewnić ciągłość refrakcji, a następnie nałożyć specjalistyczną soczewkę kontaktową na badane oko.

Kierując się obrazem dna oka w podczerwieni, skieruj laser na oko z nałożoną soczewką, dbając o to, aby wiązka była wycentrowana na tarczy nerwu wzrokowego. Wykonaj 25 skanów B w trybie wysokiej rozdzielczości, a obrazy zrasteryzuj z 30 uśrednionych skanów A. Po obrazowaniu obu oczu zastąp soczewkę kontaktową żelem oftalmicznym i umieść mysz w ogrzewanej klatce rekonwalescencyjnej.

Aby przeanalizować pozyskane obrazy za pomocą modułowego oprogramowania do obrazowania w celu zautomatyzowanej segmentacji, należy najpierw ręcznie skorygować segmenty odpowiadające błonie ograniczającej wewnętrznej oraz warstwie splotowej wewnętrznej, aby reprezentowały one granice wewnętrznych warstw siatkówki. Następnie należy zweryfikować, czy warstwa włókien nerwowych siatkówki oraz warstwa komórek zwojowych znajdują się w granicach wewnętrznej warstwy siatkówki i czy nie nakładają się na siebie. Podskórna immunizacja peptydami AQP4 zawierającymi patogenne epitopy limfocytów T wywołuje silne odpowiedzi proliferacyjne limfocytów T w drenujących węzłach chłonnych myszy z knockoutem AQP4 w porównaniu do odpowiedzi limfocytów T typu dzikiego.

Analizy cytometryczne przepływowe ekspresji poszczególnych łańcuchów V beta wykazują, że limfocyty T specyficzne dla peptydów AQP4 zawierających patogenne epitopy limfocytów T wykorzystują unikalne repertuary TCR oraz wykazują selektywną hiperproliferację, co wskazuje, że patogenne odpowiedzi limfocytów T na te determinanty są normalnie regulowane przez tymusową selekcję negatywną. Około sześciu do dziewięciu dni po wstrzyknięciu spolaryzowanych limfocytów T, prawie wszystkie myszy biorcze rozwinęły objawy kliniczne autoimmunizacyjnej choroby OUN, w tym wiotki ogon i paraliż kończyn tylnych. Przy czym limfocyty T specyficzne dla AQP4 spolaryzowane w kierunku Th17 wywoływały cięższy przebieg kliniczny choroby niż limfocyty T specyficzne dla AQP4 spolaryzowane w kierunku Th1.

Na przykład u tej myszy rozwinął się całkowity paraliż kończyn tylnych po podaniu specyficznych dla peptydu AQP4 limfocytów T spolaryzowanych do fenotypu Th17. Choroba kliniczna wywołana przez specyficzne dla peptydu AQP4 komórki Th17 wiąże się również z naciekiem komórek jednowypukłych do miąższu OUN i opon mózgowo-rdzeniowych, a także z zapaleniem nerwu wzrokowego, co potwierdza obrzęk i zwiększona grubość wewnętrznej warstwy siatkówki, która powraca do wartości wyjściowych w miarę zdrowienia myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak indukować i monitorować autoimmunizację skierowaną przeciwko AQP4, co umożliwi dalsze badania nad zrozumieniem roli limfocytów T w neuropielogniciu optycznym.