Ulepszony protokół immunoprecypitacji chromatyny z mięśni szkieletowych myszy
6 listopada 2017
Przedstawiono nowy protokół przygotowania chromatyny z mięśni szkieletowych dorosłej myszy, przystosowany do badania regulacji genów we włóknach mięśniowych przez immunoprecypitację chromatyny.
Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie chromatyny z mięśni szkieletowych dorosłej myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące regulacji genów i włókien mięśni szkieletowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona przygotowanie chromatyny klasy ChIP z mięśni szkieletowych myszy.
Tkanka odporna fizycznie o wysokiej zawartości białek strukturalnych. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy staraliśmy się scharakteryzować mechanizmy molekularne leżące u podstaw atrofii mięśni w użyciu glukoartykulowym, co wymaga identyfikacji receptorów glukoartykulacyjnych, miejsc wiążących DNA we włóknach mięśni szkieletowych myszy. Procedurę zademonstruje Shilpy Joshi, post-doc z naszego laboratorium.
Aby rozpocząć tę procedurę, odzyskaj zamrożone lub świeżo wycięte mięśnie kończyn tylnych. Następnie zmiel mięśnie w dwumililitrowej probówce, zawierającej jeden mililitr lodowatego buforu hipotonicznego do jednorodnego przygotowania małych kawałków, używając cienkich nożyczek. Następnie pozostaw rurkę wstrząśniętą na mieszadle stołowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut.
Następnie przenieś wypreparowaną tkankę do 14-mililitrowej probówki okrągłodennej zawierającej cztery mililitry zimnego buforu hipotonicznego. Homogenizuj zmieloną tkankę za pomocą mechanicznego homogenizatora tkanek przez 15 do 30 sekund. Następnie przenieś homogenat do 15-mililitrowej probówki.
Dodaj zimny bufor hipotoniczny, aby uzyskać 10 mililitrów próbki i utrwal homogenat przed przystąpieniem do następnej myszy. W tej procedurze dodaj formaldehyd do próbki, aby uzyskać 1% stężenie końcowe. A następnie wstrząsaj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie dodaj glicynę, aby uzyskać końcowe stężenie 0,125 mola w każdej probówce, aby zatrzymać utrwalanie. I wstrząsaj przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie homogenizuj utrwalony lizat, używając luźnego odbicia.
Następnie przenieś go do 15-mililitrowej probówki i wiruj przy 1000 g przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza, aby uzyskać jądra i szczątki komórkowe. Po pięciu minutach usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach świeżego buforu hipotonicznego. Przefiltruj lizat przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki.
Za pomocą końcówki pipety umyj filtr jednym mililitrem zimnego buforu hipotonicznego. Następnie należy ponownie przefiltrować filtrat przez sitko o długości 40 mikrometrów. Następnie przenieś filtrat do 15-mililitrowej probówki.
I wirować przy 1000 g przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza, aby uzyskać pastylkę jądrową. Po odrzuceniu supernatantu użyj jednego mililitra buforu hipotonicznego do zebrania trzech granulek i przeniesienia do probówki o pojemności od 1,5 do dwóch mililitrów. Wirować przy 1000 g przez pięć minut.
Następnie oceń objętość osadu jądrowego przez porównanie z probówkami zawierającymi znaną objętość cieczy i ponownie zawiesić go w buforze sonicznym do trzech do czterech razy większą od upakowanej objętości jądra. Następnie sonikować zawiesinę przez 10 do 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, używając sonikatora. Odwirować sonifikowaną próbkę i przenieść supernatant chromatyny do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra.
Aby usunąć sieciowanie, weź 30 mikrolitrów chromatyny w 1,5-mililitrowej probówce i dodaj 20 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i 450 mikrolitrów wody. Uzupełnij objętość do 500 mikrolitrów i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia wykonaj zabieg z jednym mikrolitrem Proteinazy K, 10 mikrolitrami dwóch tri molowych o pH 6,8 i 10 mikrolitrami 0,5 molowego EDTA przez godzinę w temperaturze 42 stopni Celsjusza.
Następnie wykonaj zwykłą ekstrakcję chloroformem fenolowo-chloroformowym i wytrącaj DNA jedną objętością octanu sodu i dwiema objętościami 100% etanolu przez jedną godzinę w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza lub przez noc w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza. Następnie osadzać DNA przez odwirowanie w temperaturze 13 500 g przez 15 minut. Zdekantować supernatant i dokładnie umyć osad zimnym 70% etanolem i ponownie odwirować przez pięć minut.
Następnie zdekantować supernatant i wysuszyć granulkę na powietrzu. Następnie ponownie zawiesić osad w pierwotnej objętości bufora tris HCl EDTA. Zmierz stężenie DNA w spektrofotometrze za pomocą absorbentów o długości 260 nanometrów, 280 nanometrach.
Następnie odpipetuj od 500 do 1000 nanogramów DNA razem z drabinką wielkości DNA na oddzielnych pasach 1,5% żelu agarozowego. I wykonaj elektroforezę, aby ocenić wielkość fragmentu chromatyny. Aby zoptymalizować homogenizację, homogenizację prowadzono przez 15 sekund lub 45 sekund przy dwóch prędkościach, 18 000 i 22 000 obr./min.
W każdych warunkach jądra można było oddzielić od szczątków tkanki, ale wydajność była optymalna przy mniejszej prędkości. Jądra można również przygotować, zanurzając je przez trzy do pięciu minut. Jednak homogenizacja mechaniczna jest metodą z wyboru, ponieważ optymalną wydajność jąder można osiągnąć w ciągu zaledwie 15 sekund, co pozwala na znaczne zyski czasu, zwłaszcza jeśli trzeba przetworzyć wiele próbek.
Korzystając z tego protokołu, można wyizolować do 2,7 razy od 10 do siedmiu jąder z 500 miligramów tkanki, aby wygenerować 100 mikrogramów chromatyny. Tak przygotowana chromatyna daje czyste, wysokiej jakości wyniki w eksperymentach sekwencjonowania ChIP. Ilustruje to wysoki poziom acetylowanego K27 histonu H3 i polimerazy RNA 2 w locus Desmonda wyrażonym w mięśniach.
Swoistość dla włókien mięśniowych jest pokazana przez niski lub brak sygnału w loci Pecam1 i Vcam1, które nie są wyrażane w mięśniach. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby prawidłowo zanurzyć sondę homogenizatora w próbce, aby uniknąć spienienia, wyczyścić sondę między próbkami i zoptymalizować fragmentację chromatyny. Tak przygotowana chromatyna została z powodzeniem wykorzystana ze względu na ChIP do mapowania zajętości czynników transkrypcyjnych w całym genomie i powinna być również odpowiednia do technik wychwytywania chromatyny.
Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do badań w dziedzinie genomiki, mających na celu zbadanie regulacji genów w mięśniach szkieletowych myszy. Procedura może być również stosowana do mięśni szczurów i biopsji od ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stosować homogenizację mechaniczną, a następnie oczyszczanie jąder utrwalonych formaldehydem w celu przygotowania chromatyny z mięśni szkieletowych do immunoprecypitacji.
Nie zapominaj, że praca z formaldehydem, fenolem, chloroformem i proteinazą K może być niebezpieczna. Należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i okularów. Czynności związane z tymi odczynnikami należy wykonywać pod maską.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia nowy protokół przygotowania chromatyny z mięśni szkieletowych dorosłych myszy, specjalnie dostosowany do badania regulacji genów w włóknach mięśniowych za pomocą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP). Metoda ta rozwiązuje problemy wynikające z oporu fizycznego oraz zawartości białek strukturalnych w tkance mięśni szkieletowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Regulacja genów
- Immunoprecypitacja chromatyny
- Biologia mięśni szkieletowych
Wstęp
- Przygotowanie chromatyny jest kluczowe dla badania regulacji genów.
- Szkieletowy mięsień myszy jest złożoną tkanką o wysokiej zawartości białek strukturalnych.
- Zrozumienie mechanizmów molekularnych w zaniku mięśni jest niezbędne dla opracowania strategii terapeutycznych.
- Identyfikacja miejsc wiązania DNA jest konieczna do charakterystyki regulacji genów.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnej metody przygotowania chromatyny klasy ChIP z mięśni szkieletowych myszy.
- Ułatwienie badania regulacji genów w włóknach mięśniowych.
- Zbadanie molekularnych mechanizmów leżących u podstaw zaniku mięśni.
Zastosowane metody
- Przygotowanie chromatyny z mięśni szkieletowych dorosłej myszy.
- Zastosowanie technik immunoprecypitacji chromatyny.
- Charakterystyka receptorów gluko-artykulowanych oraz miejsc wiązania DNA.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez badacza na poziomie post-doc.
Główne wyniki
- Skuteczne przygotowanie chromatyny klasy ChIP z odpornej tkanki mięśni szkieletowych.
- Identyfikacja kluczowych miejsc wiązania DNA istotnych dla regulacji genów mięśni.
- Wgląd w molekularne mechanizmy zaniku mięśni.
- Walidacja skuteczności metody na potrzeby przyszłych badań.
Wnioski
- Opracowany protokół usprawnia badanie regulacji genów w mięśniach szkieletowych.
- Stanowi on cenne narzędzie dla badaczy zajmujących się biologią mięśni.
- Przyszłe zastosowania mogą prowadzić do lepszego zrozumienia zaniku mięśni oraz schorzeń z nim związanych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Przygotowanie wysokiej jakości chromatyny z tkanek wykazujących oporność fizyczną, takich jak mięśnie szkieletowe, wciąż stanowi wąskie gardło w walidacji celów epigenetycznych. Niniejszy protokół umożliwia powtarzalną izolację jąder komórkowych oraz sonikację chromatyny odpowiednią do immunoprecypitacji, co wspiera mechanistyczną analizę ryzyka w odniesieniu do czynników transkrypcyjnych i modyfikatorów histonów w modelach chorób mięśni. Zapewniając skalowalne i zstandaryzowane podejście do przygotowania chromatyny klasy ChIP, protokół ten zwiększa pewność prognostyczną w ramach wczesnych etapów odkrywania leków koncentrujących się na patofizjologii mięśni szkieletowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie regulacji transkrypcyjnej w włóknach mięśni szkieletowych w celu walidacji celów zaangażowanych w procesy zaniku oraz szlaki metaboliczne.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną wydajność otrzymywania chromatyny z tkanki opornej, co zmniejsza zmienność w testach angażowania celu.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na otrzymanie chromatyny gotowej do ChIP w celu wysokoprzepustowego przesiewania związków wpływających na regulatory epigenetyczne w mięśniach.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane etapy oczyszczania jąder komórkowych i sonikacji wspierają powtarzalność testu w różnych laboratoriach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia dopasowanie biomarkerów poprzez mapowanie modyfikacji histonów i zajętości czynników transkrypcyjnych w modelach mięśniowych istotnych dla danej choroby.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużną analizę chromatyny z zamrożonej tkanki, wspierając ciągłość przedkliniczną i walidację celu w różnych fazach badania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków, umożliwiając przygotowanie chromatyny do walidacji celu, a następnie immunoprecypitację i sekwencjonowanie w celu wsparcia identyfikacji wiodących związków oraz oceny przedklinicznej modulatorów epigenetycznych w mięśniach szkieletowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów regulacji genów w modelach zaniku mięśni oraz chorób metabolicznych.
- Screening: Zapewnia standaryzowany substrat chromatynowy do oceny wpływu związków na cele epigenetyczne.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty z ChIP-seq w celu porównania wiązania celów w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia epigenetyczne z etapu wstępnego z walidacją przedkliniczną dzięki spójnemu przygotowaniu chromatyny.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do izolacji jąder i przygotowania chromatyny dla programów epigenetyki mięśni szkieletowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez redukcję szumu pochodzącego z chromatyny komórek innych niż mięśniowe w próbkach mięśni szkieletowych.
- Wartość operacyjna: Zwiększa przepustowość dzięki szybkiej homogenizacji mechanicznej, co umożliwia przetwarzanie wielu próbek w krótkim czasie.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go w programach ukierunkowanych na cele epigenetyczne, dostarczając wiarygodnych danych o chromatynie specyficznej dla mięśni.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie powtarzalnego profilowania epigenetycznego w tkankach istotnych dla danej choroby.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w homogenizacji tkanek, izolacji jąder komórkowych oraz pracy z chromatyną w celu uniknięcia jej degradacji.
- Zależny od dostępu do sprzętu do sonikacji zoptymalizowanego pod kątem fragmentacji chromatyny bez ryzyka przegrzania.
- Wymaga standaryzacji warunków buforowych i etapów filtracji, aby zapewnić powtarzalność wyników pomiędzy różnymi użytkownikami i ośrodkami.
- Przy zastosowaniu protokołu w modelach chorobowych należy uwzględnić zmienne specyficzne dla tkanki, takie jak typ włókien i stan urazu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność starannej optymalizacji czasu i temperatury sonikacji w celu uzyskania optymalnej wielkości fragmentów.
