Inżynieria powierzchni wysp trzustkowych z heparynizowaną nanopowłoką StarPEG
23 czerwca 2018
Ten protokół ma na celu osiągnięcie inżynierii powierzchni wysp trzustkowych za pomocą nanopowłoki starPEG z włączoną heparyną poprzez pseudo-bioortogonalną chemię pomiędzy grupami N-hydroksysukcynimidowymi nanopowłoki a grupami aminowymi błony komórkowej wysp trzustkowych.
Ta metoda może pomóc w rozwiązaniu głównych wyzwań związanych z przeszczepem wysp trzustkowych, takich jak odrzucenie immunologiczne, rewaskularyzacja wysp trzustkowych po przeszczepie i przeżycie. Główną zaletą tej techniki jest to, że to łatwe do przyjęcia podejście umożliwia inżynierię powierzchni żywych komórek poprzez przekształcenie krajobrazu komórkowego wyspy trzustkowej, co poprawi funkcję przeszczepu, przeżycie i ostatecznie skuteczność terapeutyczną przeszczepu wysp trzustkowych. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapie komórkowe, ponieważ wyniki terapeutyczne terapii komórkowych są również ograniczone przez niską retencję komórek i słabą przeżywalność.
Tę procedurę demonstruje Jingyi Yang, doktorant z mojego laboratorium. Najpierw odważ 6,9 grama heparyny i rozpuść ją w 2 mililitrach lodowatej wody dejonizowanej w probówce Eppendorfa. Rozpuść 0,23 grama NHS w 0,5 mililitra lodowatej wody dejonizowanej w probówce Eppendorfa.
Następnie rozpuść 0,77 grama EDC w 0,5 mililitra lodowatej wody dejonizowanej w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Wymieszaj roztwory NHS i EDC w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Po pozostawieniu zmieszanego roztworu w temperaturze pokojowej na 30 minut, odwirować go z prędkością 12 000 obr./min przez 10 minut, aby usunąć nadmiar EDC i NHS.
Następnie dodaj 30 mililitrów zimnego etanolu do roztworu i odwiruj z prędkością 12 000 obr./min przez 10 minut. Teraz dodaj 1 mililitr 10% starPEG MI aid do 50-mililitrowej stożkowej tuby. Następnie dodaj 0,67 mililitra 10% roztworu heparyny NHS do tej samej 50-mililitrowej stożkowej probówki.
Umieść zmieszany roztwór w inkubatorze w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 20 minut, aby uzyskać lepki, klarowny roztwór. Ręcznie wybierz 200 wcześniej wyekstrahowanych wysepek myszy pod mikroskopem preparacyjnym i przenieś do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodać 500 mikrolitrów PBS do wysepek i odwirować z prędkością 1 200 obr./min przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Usuń supernatant, dodaj 250 mikrolitrów roztworu Heparyny PEG i umieść mieszaninę na lodzie na 10 minut. Pipetować w górę i w dół, aby wysepki dobrze wymieszały się z roztworem Heparyny PEG. Następnie odwirować mieszaninę z prędkością 1 200 obr./min przez jedną minutę.
Następnie usuń supernatant i dodaj 500 mikrolitrów PBS. Pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać. Po odwirowaniu z prędkością 1 200 obr./min przez jedną minutę, usunąć supernatant i zachować wysepki do dalszego wykorzystania.
Następnie dodaj od jednego do dwóch mililitrów RPM I 1640, uzupełnionych 10% FBS do powlekanych wysepek. I przenieś te wysepki do nienaładowanego sterylnego naczynia do hodowli bakterii. Na koniec obserwuj morfologię i sygnały fluorescencyjne wysepek pokrytych FAM-Heparyną-PEG pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym.
Charakterystyczne piki heparyny, odpowiadające grupom HYDROXAL, zaobserwowano w widmie FTIR nanopowłoki Heparyna-PEG. Spadek amplitudy tych pików reprezentuje koniugację między grupami amidowymi pomocy gwiazda-PEG MI a grupą węglanową heparyny. Pik odpowiadający amidowym drganiom rozciągania węglanowego został również zmniejszony, co wskazuje na wystarczającą reakcję między grupami karboksylanu heparyny z sukcyniminianem sukcynimidem i aminą pomocową star-PEG MI.
Dane z mikroskopii elektronowej pokazują wysoce połączoną porowatą strukturę nanopowłoki Heparin-PEG, co sugeruje, że może ona być odpowiednia dla przetrwania komórek podczas dostarczania in vivo. Cienka warstwa nanopowłoki, uwidoczniona przez zieloną fluorescencję, została równomiernie osadzona na powierzchni pokrytych wysepek, nie powodując widocznych zmian w objętości lub rozmiarze wysepek. Mysia wyspa trzustkowa pokryta heparyną PEG wykazywała solidną żywotność wysepek w hodowli.
Znacznie bardziej zaawansowane tworzenie naczyń było widoczne w komórkach śródbłonka wysp trzustkowych, które były hodowane wspólnie z wyspami trzustkowymi pokrytymi heparyną-PEG, na co wskazują wydłużone struktury przypominające mikronaczynia i sieciowe struktury naczyniowe. Niski poziom wydzielania insuliny zaobserwowano we wszystkich leczonych grupach, gdy wyspy trzustkowe były perfundowane fizjologicznym roztworem soli, uzupełnionym substymulującym poziomem glukozy. Gdy wyspy trzustkowe zostały pobudzone superfizjologicznym poziomem glukozy, zaobserwowano wzrost wydzielania insuliny.
Po opanowaniu powłoki można ją wykonać w ciągu minuty, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, aby zachować żywotność wysepek.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę inżynierii powierzchniowej wysepek trzustkowych z wykorzystaniem nanopowłoki starPEG z wbudowaną heparyną. Technika ta ma na celu poprawę wyników transplantacji wysepek poprzez zwiększenie funkcji i przeżywalności przeszczepu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Terapie komórkowe
- Biologia transplantacji
- Inżynieria powierzchni
Wstęp
- Przeszczepianie wysepek trzustkowych wiąże się z takimi wyzwaniami jak odrzucenie immunologiczne i niska przeżywalność wysepek.
- Poprawa organizacji komórkowej wysepek może zwiększyć skuteczność terapeutyczną.
- Nanopowłoka z heparyny i PEG stanowi potencjalne rozwiązanie tych problemów.
- Metoda ta jest łatwa do wdrożenia i może być wykonana w krótkim czasie.
Cel badania
- Opracowanie techniki powlekania, która zwiększa przeżywalność i funkcjonalność wysepek trzustkowych.
- Rozwiązanie problemów związanych z niską retencją komórek w terapiach opartych na komórkach.
- Wykazanie skuteczności nanopowłoki z heparyny i PEG w poprawie wyników transplantacji wysepek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworów heparyny i NHS.
- Mieszanie roztworów NHS i EDC do nanopowłoki.
- Powlekanie wysepek mysich roztworem heparyny-PEG.
- Obserwacja morfologii i żywotności wysepek pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Główne wyniki
- Wyspy powlekane heparyną-PEG wykazały poprawioną żywotność w hodowli.
- Zwiększone tworzenie naczyń zaobserwowano w kokulturze komórek śródbłonka wysp.
- Sekrecja insuliny w powlekanych wyspach była reaktywna na stymulację glukozą.
- Powłoka nie zmieniła znacząco objętości ani rozmiaru wysp.
Wnioski
- Nanopowłoka z heparyny-PEG jest obiecującą metodą usprawnienia transplantacji wysepek.
- Technika ta może zwiększyć skuteczność terapii opartych na komórkach.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować inne typy komórek wymagające inżynierii powierzchni.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Inżynieria powierzchniowa wysepek trzustkowych z wykorzystaniem nanopowłoki z heparinizowanego starPEG pozwala pokonać krytyczne bariery w terapiach komórkowych, w tym odrzucenie immunologiczne i niską przeżywalność przeszczepów. Platforma ta umożliwia funkcjonalną modyfikację powierzchni żywych komórek, co sprzyja poprawie wyników transplantacji i ciągłości translacyjnej. Podejście to stanowi skalowalne, łagodne i elastyczne rozwiązanie zwiększające żywotność komórek oraz skuteczność terapeutyczną w badaniach przedklinicznych i na etapie odkryć w ramach R&D.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie strategii immunomodulacyjnych dla celów terapii komórkowej.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez zachowanie żywotności i funkcji wysepek po powleczeniu.
- Ułatwia prognozowanie przeżywalności i engraftmentu komórek w celu selekcji projektów w portfelu badawczym.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Służy do przygotowania zestandaryzowanych, zmodyfikowanych powierzchniowo wysepek trzustkowych do dalszych analiz funkcjonalnych.
- Zapewnia powtarzalność oraz ilościową ocenę żywotności wysepek i sekrecji insuliny.
- Umożliwia wiarygodną ocenę ochrony immunologicznej i unaczynienia w procesach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla chorób w kontekście transplantacji wysepek i badań nad odpowiedzią immunologiczną.
- Zapewnia ciągłość od inżynierii in vitro do walidacji transplantacji in vivo.
- Umożliwia mechanistyczne ograniczenie ryzyka w zakresie retencji i przeżywalności komórek w modelach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda nanopowłok wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, wspierając wczesne testowanie hipotez i umożliwiając solidną walidację przedkliniczną terapii komórkowych.
- Biologia odkrywcza: Usprawnia weryfikację hipotez dotyczących mechanizmów unikania odpowiedzi immunologicznej i przeżywalności przeszczepów.
- Screening: Zapewnia powtarzalne i mierzalne wyniki w zakresie żywotności i funkcji wysepek.
- Analityka: Dostarcza mierzalne odczyty, takie jak wydzielanie insuliny i parametry unaczynienia.
- Badania translacyjne: Łączy inżynierię in vitro z badaniami nad transplantacją in vivo w celu dopasowania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje modułową platformę możliwą do dostosowania do różnych typów komórek i mediatorów funkcjonalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie przeżywalności komórek i ochrony immunologicznej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje inżynierię powierzchni komórek przy minimalnym wpływie na ich żywotność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go dla kandydatów do terapii komórkowej i zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów terapeutycznych opartych na komórkach z uwzględnieniem dostosowania do ryzyka.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w izolacji komórek, chemii powierzchni oraz technikach nanopowłok.
- Wymaga dostępu do mikroskopii fluorescencyjnej i aparatury analitycznej w celu walidacji.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej dla zapewnienia powtarzalności przygotowania i powlekania wysepek.
- Możliwość adaptacji do różnych typów komórek i mediatorów funkcjonalnych, zgodnie z zakresem projektu platformy.
- Ograniczenia praktyczne obejmują utrzymanie żywotności komórek oraz zapewnienie jednorodnego pokrycia powłoką.
