Usprawniony protokół różnicowania móżdżku 3D z opcjonalną modyfikacją 2D
9 grudnia 2017
Opisujemy uproszczony protokół różnicowania 3D dla hPSC, wykorzystujący zdefiniowane czynniki wzrostu pożywki i zredukowanej, zdolny do generowania agregatów komórkowych z wczesnymi strukturami neuroepitelicznymi i dodatni dla markerów związanych z móżdżkiem, a także opcjonalną modyfikację 2D do różnicowania komórek jako monowarstwę do generowania funkcjonalnych neuronów.
Ogólnym celem tych kultur różnicujących jest wygenerowanie linii komórek móżdżku w środowiskach 2D lub 3D. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na podstawowe pytania dotyczące nowych osiągnięć lub mechanizmów chorobowych leżących u podstaw zaburzeń mózgu u dzieci przy użyciu komórek macierzystych pochodzących od pacjenta. Główną zaletą tej techniki jest to, że ma proste uruchamianie i konserwację z niewielką liczbą czynników oraz że może być używana jako podstawa do testowania bardziej złożonych protokołów neuronowych. Procedurę zademonstruje Lisa, technik z mojego laboratorium. Aby ustawić różnicowanie za pomocą zmodyfikowanej metody G-metoda przechodzenia hPSC, przenieś wymaganą objętość pożywki podtrzymującej neurony do sterylnej probówki i uzupełnij 4 nanogramami na mililitr FGF2 i dziesięcioma inhibitorami skał mikromolowych. Następnie utrzymuj probówkę z pożywką w temperaturze pokojowej lub w łaźni wodnej o temperaturze 37
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia uproszczony protokół trójwymiarowego (3D) różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs), w którym wykorzystano zdefiniowane medium oraz zredukowaną liczbę czynników wzrostu. Protokół ten umożliwia generowanie agregatów komórkowych z wczesnymi strukturami neuroepithelialnymi oraz markerami związanymi z rozwojem móżdżku.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórek macierzystych
- Różnicowanie komórek
Wstęp
- Zrozumienie linii komórkowych móżdżku ma kluczowe znaczenie dla badania schorzeń mózgu u dzieci.
- pochodne od pacjenta komórki macierzyste mogą dostarczyć wiedzy na temat mechanizmówy chorobowych.
- Celem protokołu jest uproszczenie procesu różnicowania.
- Umożliwia on hodowlę zarówno w środowisku 2D, jak i 3D.
Cel badania
- Opracowanie prostego метода generowania typów komórek móżdżku.
- Ułatwienie badań nad zaburzeniami mózgu u dzieci.
- Stworzenie podstaw dla bardziej złożonych protokołów różnicowania neuronów.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie zdefiniowanego medium do utrzymania neuronów.
- Suplementacja FGF2 oraz inhibitorem ROCK.
- Kultury hPSC w formatach 2D i 3D.
- Monitorowanie różnicowania w kierunku linii komórkowych móżdżku.
Główne wyniki
- Skuteczne generowanie agregatów komórkowych z strukturami neuroepithelialnymi.
- Ekspresja markerów związanych z móżdżkiem w zróżnicowanych komórkach.
- Wykazanie prostoty i skuteczności protokołu.
- Potencjał do dalszego zastosowania w złożonych badaniach neuronalnych.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę różnicowania komórek móżdżku.
- Może on zostać dostosowany do różnych zastosowań badawczych w neuronaukach.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych podstawach w celu prowadzenia zaawansowanych badań nad układem nerwowym.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten usprawniony protokół różnicowania móżdżku zmniejsza złożoność i koszty generowania linii komórkowych móżdżku pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, wspierając wczesną walidację celów w badaniach nad zaburzeniami mózgu u dzieci. Poprzez minimalizację zewnętrznych czynników wzorowania, obniża on ryzyko wystąpienia zakłócających fenotypów chorobowych w modelach hPSC, zwiększając pewność prognostyczną w przedklinicznej ocenie ryzyka celów terapeutycznych. Elastyczność formatu dualnego 2D/3D umożliwia skalowalny rozwój testów i dostosowanie biomarkerów translacyjnych w ramach procesów badawczych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceuticals
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących móżdżku z wykorzystaniem komórek macierzystych pochodzących od pacjentów w celu wyjaśnienia mechanizmów choroby.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez uproszczenie procesu różnicowania przy użyciu mniejszej liczby czynników zewnętrznych, które mogłyby maskować fenotypy.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych odczytów ekspresji markerów związanych z móżdżkiem oraz napływu wapnia w celu przesiewania związków.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację i powtarzalność analizy zarówno w formacie 2D (komórki przylegające), jak i 3D (wolno zawieszone).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Dostarcza istotnych z punktu widzenia chorób modeli komórkowych z strukturami przypominającymi wargę rombową i strefę komorową do walidacji przedklinicznej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka dzięki spójnej i skalowalnej generacji neuronów móżdżku.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących punktów uchwytu po identyfikację związków wiodących, wspierając generowanie linii komórkowych móżdżku do screeningu mechanistycznego i odkrywania biomarkerów.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego we wczesnej walidacji celów w obrębie móżdżku.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, ilościowe wyniki, w tym ekspresję markerów oraz funkcjonalny przepływ jonów wapnia do oceny związków.
- Analityka: Umożliwia analizę porównawczą wydajności różnicowania i dojrzewania neuronów w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość od etapu odkrycia do badań przedklinicznych poprzez produkcję neuronów móżdżku istotnych w kontekście danej choroby.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako adaptacyjna platforma bazowa do testowania usprawnionych protokołów różnicowania neuronalnego w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Wyższa pewność predykcyjna w walidacji celów dzięki redukcji szumu fenotypowego i zwiększonej wierności modelu.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, efektywność kosztowa i skalowalność w systemach hodowli 2D i 3D.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go dzięki ograniczeniu biologicznego ryzyka na późnych etapach programów ukierunkowanych na cele w móżdżku.
- Wpływ na portfolio: Umożliwienie priorytetyzacji celów w móżdżku z uwzględnieniem ryzyka przy użyciu wiarygodnych i skalowalnych modeli chorobowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek macierzystych oraz umiejętności opracowywania składu zdefiniowanych pożywek.
- Zależne od dostępu do FGF2, inhibitora ROCK oraz infrastruktury do stosowania pożywek do utrzymania neuronów.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójności wykonania formatów 2D i 3D.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów podczas skalowania z hodowli monowarstwowych do hodowli agregatów typu organoidy.
- Ograniczone potrzebą przeprowadzenia testów walidacji funkcjonalnej, poza analizą ekspresji markerów, w celu potwierdzenia dojrzałości neuronów.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
3D "Organoid" Differentiation
4:32
Alternative 2D Differentiation Culture
8:28
Results: 3D Products Exhibit Markers and Structures of Early Neuroepithelium, and 2D Products Exhibit Cerebellar Markers and Functional Neuronal Activity
9:48
Conclusion
