Funkcjonalizacja powierzchni nanocząstek wirusa zapalenia wątroby typu E przy użyciu metod koniugacji chemicznej

Ogólnym celem chemicznej funkcjonalizacji powierzchni nanocząsteczek HEV jest opracowanie powtarzalnego i spójnego podejścia do koniugacji celujących cząsteczek immunogennych, terapeutycznych i diagnostycznych z powierzchnią nanocząsteczek HEV w celach diagnostycznych i terapeutycznych.

Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nanomedycyny, takie jak sposób monitorowania zwiększonego celowania w nowotwory oraz dystrybucji nanoleków. Główną zaletą tej techniki jest jej wysoka powtarzalność i wydajność, a także znacznie łatwiejsza implementacja w porównaniu do inżynierii genetycznej.

Procedury zaprezentują Michelle Nguyen i Ivan Ruiz, asystenci badawczy z naszego laboratorium.

Niniejszy protokół należy rozpocząć od produkcji i oczyszczania nanocząsteczek wirusa zapalenia wątroby E, zgodnie z opisem zawartym w protokole tekstowym.

Rozcieńczyć próbki nanocząsteczek HEV do stężenia od 0.5 do 2 mg/mL w 10 mM MES, pH 6.2 w celu wykonania obrazowania TEM. Zjonizować siatki powlekane węglem za pomocą wyładowań żarowych (glow discharge) o natężeniu 40 mA przez 30 s, aby uzyskać hydrofilową powierzchnię węglową. Hydrofilowa powierzchnia węglowa siatek zachowuje swoje właściwości jedynie przez 30 min po zabiegu wyładowań żarowych. Po jonizacji, trzymając siatkę i pęsetę, nanieść 2 µL próbki nanocząsteczek HEV na siatkę.

Po 15 do 30 sekund osusz siatkę papierem filtracyjnym. Następnie niezwłocznie przemyj siatkę podwójnie destylowaną wodą i ponownie osusz papierem filtracyjnym. Natychmiast nanieś na siatkę 2 µL 2% octanu uranylu. Po 15 sekundach osusz siatkę papierem filtracyjnym. Wysusz siatki z próbkami, umieszczając je na noc w elektronicznej szafie osuszającej.

W zależności od próbki, w celu wizualizacji i charakterystyki struktury niezbędna może być kriomikroskopia elektronowa (cryo-EM). Przenieś siatkę do TEM i wykonaj obrazowanie przy powiększeniu od 10 do 80K. Nanocząstki HEV w TEM jawią się jako puste białka ikosaedryczne o średnicy około 27 nanometrów, co wynika z braku wirusowego RNA.

Aby przeprowadzić jednokrokową konjugację nanocząsteczek HEV i biotyny sprzężonej z maleimidem, najpierw umieść nanocząsteczki HEV w mini jednostkach dializacyjnych. Dializuj nanocząsteczki przeciwko 0,01 M PBS pH 7,4 w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę zgodnie z protokołem producenta. Po dializie przenieś nanocząsteczki HEV do probówek 1,5 ml i zmierz stężenie białka przy 280 nm za pomocą spektrofotometru. Wymieszaj nanocząsteczki o stężeniu 1 mg/ml z równą ilością 100 µM maleimidu-biotyny oraz 0,01 M PBS pH 7,4, aby uzyskać stosunek molowy od 1:5. Po inkubacji przez noc w temperaturze 4 °C usuń niezwiązaną biotynę z maleimidem za pomocą kolumny do odsolania w wirowce (spin desalting column) zgodnie z protokołem producenta. Przeanalizuj próbki za pomocą standardowej redukującej elektroforezy SDS-PAGE.

Zgodnie ze standardowymi procedurami należy przeprowadzić chemiluminescencyjny Western blot z wykorzystaniem streptawidyny sprzężonej z HRP, a następnie zarejestrować sygnał chemiluminescencyjny za pomocą filmu rentgenowskiego.

Aby przeprowadzić dwuetapową konjugację liganda specyficznego dla komórek raka piersi, LXY30, do cysteiny wyeksponowanej na powierzchni nanocząsteczek HEV, najpierw umieść nanocząsteczki w mini jednostkach dializacyjnych i dializuj przeciwko 0,01 molarne PBS pH 7,4 w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie przenieś nanocząsteczki HEV do probówek 1,5 ml i zmierz stężenie białka przy 280 nm za pomocą spektrofotometru. Dalej połącz 650 µM maleimidu-azydu i 650 µM alkinu-LXY30 z 200 µM siarczanu miedzi i 1 mM kwasem askorbinowym. W ten sposób powstaje maleimid-LXY-30 o stężeniu 650 µM. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia zmieszaj nanocząsteczki HEV o stężeniu 1 mg/ml z około 10% objętości maleimid-LXY30, aby uzyskać stosunek molowy od 1 do 3. Reakcję prowadź przez noc w temperaturze 4 °C. Ze względu na stosunkowo wysokie stężenie maleimid-LXY30, końcowe stężenia substratów, takich jak siarczan miedzi, ulegają zmniejszeniu około 10-krotnie po zmieszaniu. Aby uniknąć ich szkodliwego wpływu na nanocząsteczki wirusa zapalenia wątroby typu E, alternatywną opcją jest metoda konjugacji bezmiedziowej.

Nieprzypisaną maleimidową cząsteczkę LXY30 usuń za pomocą kolumny do odsalania w wirowce zgodnie z protokołem producenta. Nanocząsteczki HEV połączone z LXY30 przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić jednoczynnikową konjugację nanocząsteczek HEV LXY30 z znacznikiem fluorescencyjnym Cy5.5, najpierw zmieszaj nanocząsteczki połączone z LXY30 o stężeniu jeden miligram na mililitr z równą objętością znacznika fluorescencyjnego Cy5.5, aby uzyskać stosunek molowy jeden do pięciu. Po inkubacji mieszaniny przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, usuń nieprzypisany Cy5.5 NHS za pomocą procedury z wykorzystaniem kolumny do odsalania w wirowce zgodnie z protokołem producenta. Nanocząsteczki HEV połączone z LXY30 i Cy5.5 przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

W celu funkcjonalizacji nanocząsteczek HEV za pomocą LXY30 do celowania w komórki nowotworowe przetestowano dwie metody. W przypadku, gdy nanocząsteczki HEV 573C zostały najpierw powiązane z maleimidem azotkowym, a następnie poddane reakcji chemii klik z alkinem LXY30, w obserwacjach TEM zaobserwowano rozpad nanocząsteczek HEV 573C. Jednakże wstępna reakcja chemii klik pomiędzy alkinem LXY30 a maleimidem azotkowym w celu utworzenia LXY30 połączonego z maleimidem, a następnie konjugacja z odpowiednio zmodyfikowanymi nanocząsteczkami HEV, nie wpłynęła na ich strukturę, a nanocząsteczki HEV 573C pozostały nienaruszone. Nanocząsteczki HEV połączone z LXY30 oraz Cy5.5 zastosowano do hodowlanych komórek raka piersi i poddano obserwacji za pomocą mikroskopii konfokalnej. Obrazy fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej wskazują, że nanocząsteczki HEV połączone z LXY30 i Cy5.5 wykazywały wyższe powinowactwo wiązania, co prowadziło do zwiększonej internalizacji w komórkach raka piersi MDA MB-231 w porównaniu z nanocząsteczkami HEV połączonymi z Cy5.5.

Zastosowania tej techniki obejmują badanie wielomodalnego celowania oraz cząsteczek terapeutycznych, które umożliwiają precyzyjne nakierowanie i diagnostykę nowotworu bez uszkadzania zdrowych komórek. Choć metoda ta pozwala na pogłębienie wiedzy na temat raka i celowania w guzy poprzez chemiczną modyfikację powierzchni, może ona zostać wykorzystana w wczesnej diagnostyce nowotworów, przesiewowo oraz w leczeniu wspomaganym obrazowaniem.