Wykrywanie wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi lub innymi białkami. Ta procedura wymaga, aby jedno białko było znakowane histydyną i nadmiernie eksprymowane w komórkach, podczas gdy drugie jest peptydem znakowanym myc. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania z zakresu biochemii ważnych badań interakcji białek.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykrycia interakcji między białkami błonowymi w sposób wrażliwy na detergenty. Procedura jest szybka i łatwa. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat interakcji białek błonowych, może być również stosowana do badania słabych oddziaływań białek.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy chcieliśmy sprawdzić interakcję między białkami błonowymi, Saltiliną i GLUT4, ale próby koimmunoprecypitacji ich z lizy ssaków pozostają nieudane. Aby złożyć zamówienie na peptyd, wybierz docelową sekwencję peptydu krytyczną dla interakcji i dodaj epitop myc na końcu lub końcu C sekwencji. Po przybyciu peptydu należy podać 100 mikrogramów na mililitr roztworu roboczego peptydu w ultra czystej wodzie.

Wysiewaj trzy komórki preadipocytów 3T3-L1 w czterech 10-centymetrowych szalkach hodowlanych i trzymaj w inkubatorze. Następnie przetransfekuj dwie szalki hodowlane z docelowym białkiem oznaczonym 6X histodyn i oznacz jako HISP w pozostałych dwóch szalkach dwoma plazmidami kontrolnymi i oznacz jako WT. Po transfekcji pozostaw komórki w inkubatorze na 48 godzin, aby osiągnąć 80 do 90% zgrywu. Aby przygotować lizat komórkowy, umyj komórki na lodzie trzy razy 10 mililitrami 1X buforowanej soli fizjologicznej schłodzonej o czterech stopniach Celsjusza.

Następnie do każdego z nich dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy. Następnie odłącz komórki od naczyń za pomocą skrobaka do komórek, aby przygotować lizat. Przenieś lizat komórkowy przygotowany z każdej płytki hodowlanej do czterech oddzielnych probówek o średnicy 1,5 milimetra i oznacz wszystkie probówki.

Następnie przepuść lizat komórkowy przez strzykawkę z igłą o rozmiarze 26 w górę iw dół pięć razy, aby uzyskać całkowitą lizę komórek. Następnie odwiruj lizaty komórkowe w temperaturze 16000xg przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatanty do czterech identycznie oznakowanych nowych probówek.

Do przyszłych eksperymentów rozwiązywaniem problemów i kontrolnych należy podać 20 mikrolitrów lizatu komórkowego i przechowywać go w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Do późniejszego użycia należy mianować bufor do przemywania przy PH8 kwasem solnym w celu uzyskania PH6 i przechowywać bufor w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie, aby przygotować jednorodną zawiesinę koralików kobaltowych, ostrożnie zakręć butelką.

Następnie przenieś 40 mikrolitrów zawiesiny kulek kobaltowych do wszystkich indywidualnie oznaczonych czterech probówek. Po dodaniu kulek kobaltu dodaj jeden mililitr buforu do lizy do probówek. Następnie odwiruj probówki o mocy 1000 x g przez pięć sekund.

Odrzucić supernatant i odpipetować 40 mikrolitrów buforu do lizy do osadzonych kulek. Następnie przenieś lizat komórkowy do odpowiednich probówek i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 90 minut na rotatorze probówkowym. Po 90 minutach odwirować próbki o sile 1000 x g przez pięć sekund.

Następnie zebrać supernatant oznaczony jako Flowthrough-1 i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania z PH8 do poszczególnych probówek i delikatnie ponownie zawieś kulki. Odwirować probówki o stężeniu 1000xg przez pięć sekund i usunąć supernatanty.

Następnie dodaj bufor do płukania z PH8 z lub sześcioma do probówek, zgodnie z etykietami i ponownie dobrze zawieś kulki. Odwirować probówki o stężeniu 1000xg przez pięć sekund i usunąć supernatanty. Przygotować jeden mikrogram na mililitr roztworu roboczego peptydu i buforu wodnego o PH6 lub ośmiu.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu peptydu do umytych kulek odpowiadających podobnemu PH. Następnie inkubuj kulki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze rurowym przez 30 minut. Następnie weź cztery mikrokolumny, oznacz je i umieść w probówkach zbiorczych oznaczonych Flowthrough-2. Po zakończeniu inkubacji dodać mieszaninę inkubacyjną do kolumn.

Pozwól, aby roztwór przeszedł przez siłę grawitacyjną i zbierz próbkę ze przepływu. Umieść kolumny w nowych probówkach zbiorczych i przechowuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie przepuścić 500 mikrolitrów buforu płuczącego o PH6 lub ośmiu przez przepływ grawitacyjny przez poszczególne kolumny i odrzucić przepływ.

Powtórz ten krok cztery razy. Odwiruj probówki o sile 1000 x g przez pięć sekund. Umieść kolumnę w nowej probówce zbiorczej oznaczonej jako Elution.

Ważne jest, aby umyć kulki we wszystkich probówkach bardzo dokładnie i równomiernie, aby pozbyć się niezwiązanego peptydu. Do umytych kulek dodać 40 mikrolitrów buforu do próbek trysyny z beta-merkaptoetanolem. Pozostaw na 20 minut w temperaturze pokojowej.

Odwiruj kolumnę przy 8000xg przez dwie minuty. Wyrzuć kolumny i podgrzewaj probówki zbiorcze w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut. A następnie odwiruj go przy 1000xg przez pięć sekund.

Alternatywnie dodać 40 mikrolitrów buforu imidazolu elucji do umytych kulek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji odwirować probówki o wymiarach 8000xg przez dwie minuty. Odrzucić kolumny i dodać 40 mikrolitrów próbki tryciny.

Podgrzej probówki zbiorcze w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie odwiruj je w temperaturze 1000 x g przez pięć sekund. Stosuj dostępne na rynku żele gradientowe 10-20% tricine. Użyj buforu do biegania Tris / Tricine / SDS, a następnie załaduj 20 mikrolitrów każdej z eluowanych próbek i całkowitych lizatów na żel i rozpocznij pracę jednostki elektroforezy.

Po zakończeniu elektroforezy należy użyć buforu transferowego uzupełnionego 20% metanolem, aby przenieść materiał z żelu na membranę nitrocelulozową o grubości 0,45 mikrometra. Po zablokowaniu membrany przetnij ją poziomo. Następnie zbadaj górną część błony przeciwciałem Anti His P w dolnej połowie błony za pomocą anty myc.

W celu zbadania interakcji między unieruchomionym Sortiliną a kulkami kobaltu w GLUT4 przeprowadzono analizę immunoblot. Lizaty i eluaty komórkowe uzyskano w postaci dzikich i transfekowanych komórek 3T3-L1 oznaczonych Sortilin-myc/His, a następnie załadowano na stronę SDS. Plamę badano przeciwciałem anty-myc.

Blot pokazuje 110 kilodotin Sortili-myc/His-tagged i pięć kilotin myc-first luminal loop-GLUT4 z transfekowanych eluatów. Następnie, w celu zbadania znaczenia PH i interakcji między Sortiliną unieruchomioną na kulkach kobaltowych a GLUT4, przeprowadzono analizę immunoblot. W tym teście pierwszą pętlę luminalną Myc-First GLUT4 inkubowano z kulkami unieruchomionymi białkami znakowanymi Sortilin-myc/His, zarówno przy PH6, jak i ośmiu.

Blot wykazuje wyraźną interakcję między Sortilin-myc/His a myc-pierwszą pętlą luminalną GLUT4 zarówno przy PH6, jak i ośmiu z eluatów uzyskanych z transfekowanych komórek 3T3-L1 znakowanych Sortilin-myc/His. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech godzin, aż próbki będą gotowe do analizy krwi zachodniej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zaprojektowaniu peptydu, który jest rozpuszczalny, najlepiej w wodzie.

Aby wzmocnić wyniki, można wykonać inne metody, takie jak immunoprecypitacja po usieciowaniu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykrywać białko błonowe, interakcje białek w procedurze wrażliwej na detergenty. Pozwala również na badanie interakcji między fragmentami białek.

Miękki rytmiczny jazz.