Dwie metody decelularyzacji tkanek roślinnych do zastosowań w inżynierii tkankowej
31 maja 2018
Tutaj prezentujemy i porównujemy dwa protokoły używane do decelularizacji tkanek roślinnych: podejście oparte na detergentach i podejście bez detergentów. Obie metody pozostawiają macierz zewnątrzkomórkową zastosowanych tkanek roślinnych, które można następnie wykorzystać jako rusztowania do zastosowań w inżynierii tkankowej.
Metody te mogą pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w dziedzinie biomateriałów, takich jak opracowanie rusztowania o doskonałych możliwościach przenoszenia płynów z zaawansowanymi ultrastrukturami i skalowalną produkcją. Główną zaletą tych technik jest to, że można je stosować do większości roślin na tkanki łodygowe bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu. Najpierw zbierz świeże lub mrożone próbki liści F.hispida.
Pozostałą świeżą próbkę należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Niech liść pozostanie zanurzony w dejonizowanej wodzie w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza. Użyj czystego stempla do biopsji, aby pociąć liść na krążki o średnicy ośmiu milimetrów.
Następnie, aby umyć próbki liści, inkubuj je na płytce wstrząsającej z niską prędkością przez pięć do 10 minut, zanurzając w wodzie dejonizowanej. Następnie przygotuj 10% wagowo SDS w wodzie dejonizowanej. Po przygotowaniu roztworu SDS umieść próbki liści na plastikowym naczyniu.
Następnie dodaj roztwór SDS, aby całkowicie pokryć próbki. Umieścić próbki liści z kartą charakterystyki SDS, przykryte, na płycie wstrząsającej, aby zapobiec parowaniu. Następnie inkubuj próbkę liści w temperaturze pokojowej przez pięć dni.
Po pięciu dniach inkubacji zastąp roztwór SDS wodą dejonizowaną. Próbki namoczone w wodzie dejonizowanej inkubować przez 10 do 15 minut na płytce wstrząsającej. Następnie wymieszaj pięć mililitrów niejonowego środka powierzchniowo czynnego z 50 mililitrami wybielacza.
Dodaj tę mieszaninę do 445 mililitrów wody dejonizowanej. Następnie zanurz próbki w świeżo przygotowanym roztworze wybielacza niejonowego środka powierzchniowo czynnego. Kontynuuj wymianę roztworu wybielacza niejonowego środka powierzchniowo czynnego co 24 godziny, aż próbki zostaną oczyszczone.
Następnie pozostaw oczyszczone próbki zanurzone w wodzie dejonizowanej na dwie minuty na płytce wstrząsającej. Aby uzyskać decelularyzację bez detergentów, przygotuj pięcioprocentowy obj. wybielacz w 3% wagowym roztworze wodorowęglanu sodu. Następnie podgrzej roztwór do 60 do 70 stopni Celsjusza na płycie grzejnej w dygestorium.
Gdy tylko roztwór osiągnie pożądaną temperaturę, namocz próbki liści. Następnie zmniejsz prędkość płytki mieszającej, aby zapobiec uszkodzeniu próbek, poszukaj widocznie oczyszczonych próbek i ostrożnie przenieś je z kąpieli. Na koniec inkubować próbki w wodzie dejonizowanej przez jedną do dwóch minut.
Ponieważ wszystkie próbki są wewnętrznie różne, zaleca się sprawdzanie postępu decelularyzacji mniej więcej co 15 minut, aby upewnić się, że próbki nie są uszkodzone. Parametry MTM, SAF i UTS są najpierw badane w celu zbadania unikalnych właściwości rusztowań decelularnych zarówno gatunków P.aquatica, jak i F.hispida. W rzeczywistości wszystkie trzy parametry wykazują podobne właściwości mechaniczne zarówno przy użyciu metod decelularizacji na bazie detergentów, jak i bez detergentów.
Jednak właściwości mechaniczne UTS F.hispida wykazują znacznie wyższą średnią wartość przy użyciu SDS zamiast wybielacza do decelularyzacji. Zawartość genomowego DNA badanych oczyszczonych gatunków roślin jest również znacznie zmniejszona po decelularizacji w porównaniu z próbkami bez decelularyzacji. Następnie mierzy się również aktywność metaboliczną ludzkich tyroblastów skórnych w obecności bezkomórkowych rusztowań P.aquatica lub Garcinia.
Co ciekawe, rusztowania na bazie detergentów wywoływały zmniejszony wpływ na komórkową aktywność metaboliczną, ale mycie buforem trishydrochlorkowym, a następnie pożywką bez surowicy po usunięciu SDS zmniejsza wpływ na komórkową aktywność metaboliczną w porównaniu z myciem samą wodą dejonizowaną. Wreszcie pokazano wzrost mezenchymalnych komórek macierzystych barwionych kalcynacją na powierzchni struktury liścia F.hispida. Po opanowaniu techniki te można wykonać w ciągu około siedmiu dni do zaledwie 15 minut, jeśli są wykonywane prawidłowo.
Podczas wykonywania tych procedur należy pamiętać o monitorowaniu próbek podczas ich decelularyzacji, ponieważ próbki mogą się różnić w zależności od partii, co może skutkować różnymi czasami oczyszczania. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak dekwantyfikacja lub badania mechaniczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jakim stopniu próbki są oczyszczane i do jakich innych tkanek próbki są mechanicznie podobne. Po opracowaniu technika ta pomogła utorować drogę naukowcom zajmującym się inżynierią tkankową do produkcji perfuzyjnych rusztowań.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak decelularyzować tkanki roślinne do wykorzystania jako rusztowania. Nie zapominaj, że praca z detergentami i oparami wybielaczy może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tych procedur należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie odpowiedniego sprzętu ochronnego i używanie dygestorio.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia i przeciwstawia dwa protokoły decelularyzacji tkanek roślinnych: metodę opartą na detergentach oraz metodę bez użycia detergentów. Obie metody pozwalają zachować macierz zewnątrzkomórkową, która może służyć jako rusztowania w zastosowaniach z zakresu inżynierii tkankowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biomateriały
- Inżynieria tkankowa
- Biologia roślin
Wstęp
- Techniki decelularyzacji są kluczowe dla tworzenia rusztowań.
- Rusztowania mogą zwiększać zdolność do transportu płynów.
- Metody te można zastosować do różnych tkanek łodygowych roślin.
- Do zastosowania tych technik nie jest wymagany specjalistyczny sprzęt.
Cel badania
- Porównanie metod decelularyzacji z użyciem detergentów i bez ich zastosowania.
- Ocena potencjału roślinnych macierzy pozakomórkowych jako rusztowań.
- Rozwiązanie problemów związanych z opracowywaniem rusztowań do inżynierii tkankowej.
Zastosowane metody
- Pozyskanie świeżych lub zamrożonych próbek liści F.hispida.
- Przechowywanie próbek w temperaturze -20 °C.
- Zanurzenie liści w wodzie dejonizowanej w temperaturze od 20 do 25 °C.
- Wycinanie z liści krążków o średnicy 8 mm przy użyciu wycinaka do biopsji.
Główne wyniki
- Obie metody decelularyzacji skutecznie zachowują macierz zewnątrzkomórkową.
- Utworzone rusztowania mogą być wykorzystywane w różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej.
- Zwiększono zdolność rusztowań do transportu płynów.
- Metody są skalowalne i możliwe do zastosowania u większości gatunków roślin.
Wnioski
- Techniki decelularyzacji zapewniają funkcjonalne rusztowania do inżynierii tkankowej.
- Obie metody mają wyraźne zalety i mogą być dobierane w zależności od konkretnych potrzeb.
- Przyszłe badania mogą zgłębić dodatkowe zastosowania rusztowań pochodzenia roślinnego.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Rusztowania pochodzenia roślinnego rozwiązują krytyczne problemy z biomateriałami w inżynierii tkankowej, oferując skalowalne i biokompatybilne alternatywy dla przeszczepów autologicznych, syntetycznych oraz pochodzenia zwierzęcego. Opisane metody decelularyzacji umożliwiają powtarzalną produkcję rusztowań z zachowaną architekturą macierzy zewnątrzkomórkowej, co zapewnia transport płynów i funkcjonalność mechaniczną, niezbędne w zastosowaniach medycyny regeneracyjnej. Dzięki temu systemy oparte na roślinach stanowią strategiczną opcję ograniczającą ryzyko we wczesnych etapach rozwoju rusztowań w badaniach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wpływu macierzy zewnątrzkomórkowej na biozgodność i integralność mechaniczną rusztowania.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane procedury przygotowania tkanek roślinnych, które można stosować u różnych gatunków bez użycia specjalistycznego sprzętu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie rusztowań o mierzalnych właściwościach mechanicznych (UTS, MTM, SAF), co umożliwia porównawcze przesiewanie biomateriałów.
- Wartość operacyjna: Wspiera produkcję rusztowań gotowych do analiz, przy niskim wpływie na metabolizm komórkowy, co umożliwia powtarzalne eksperymenty z wysiewem komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia ocenę reakcji ludzkich komórek (np. dermalnych tyreoblastów, mezenchymalnych komórek macierzystych) na macierzach pochodzenia roślinnego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia elastyczność dzięki zastosowaniu dwóch metod (z użyciem detergentu lub bez detergentu) w celu optymalizacji właściwości rusztowania dla konkretnych celów inżynierii tkankowej.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metody decelularyzacji te wpisują się w proces odkrywczości, dostarczając przygotowanych rusztowań do testów opartych na komórkach, co wspiera przejście od przesiewania biomateriałów do walidacji przedklinicznej w procesach inżynierii tkankowej.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących przydatności macierzy zewnątrzkomórkowej roślin jako fundamentu rusztowania.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych rusztowań o mierzalnych parametrach mechanicznych i biologicznych do oceny porównawczej.
- Analityka: Generuje dane ilościowe (redukcja genomowego DNA, aktywność metaboliczna, UTS), które służą do określenia kryteriów wyboru rusztowania.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość procesu od odkrycia biomateriału do testów przedklinicznych poprzez standaryzowaną produkcję rusztowań.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia niezależny od platformy protokół, który można dostosować do wielu gatunków roślin, co zwiększa efektywność wykorzystania zasobów w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w ocenie wydajności rusztowań poprzez oddzielenie wkładu komórkowego od wkładu macierzy pozakomórkowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji czasów inkubacji, stężeń roztworów oraz etapów płukania.
- Wartość strategiczna: Obniża bariery rozwojowe poprzez eliminację potrzeby stosowania specjalistycznego sprzętu, co umożliwia szersze zastosowanie w laboratoriach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera optymalizację postępów z uwzględnieniem ryzyka poprzez dostarczenie rusztowań o regulowanych właściwościach (np. modulacja UTS za pomocą SDS w porównuciu do wybielacza).
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z biomateriałami oraz monitorowaniu procesu decelularyzacji, aby zapobiec nadmiernemu przetworzeniu tkanki.
- Wymaga dostępu do standardowego wyposażenia laboratoryjnego (inkubatora z wytrząsaniem, płyty grzejnej, dygestorium, wycinaka do biopsji) oraz odczynników (SDS, wybielacz, wodorowęglan sodu).
- Wymaga standaryzacji oceny punktu końcowego oczyszczania w ramach zespołu (np. czasu inspekcji wizualnej), aby zapewnić spójność między partiami.
- Wymaga dostosowania czasu inkubacji w zależności od gatunku rośliny i grubości tkanki, zgodnie z obserwacjami dotyczącymi zmienności próbek.
- Wiąże się z kwestiami bezpieczeństwa przy pracy z detergentami i wybielaczem, w tym stosowaniem środków ochrony indywidualnej (PPE) oraz pracą w dygestorium podczas etapów z podgrzewaniem.
