Test labiryntu Elevated Plus w połączeniu z oprogramowaniem do śledzenia wideo w celu zbadania przeciwlękowego działania egzogennych suplementów ketogenicznych
7 stycznia 2019
Tutaj prezentujemy protokół do badania zmian w poziomie lęku u modeli gryzoni. Test elevated plus maze (EPM), stosowany w połączeniu z oprogramowaniem do śledzenia wideo, zapewnia niezawodną metodę dokumentowania efektu różnych potencjalnych terapii przeciwlękowych w przedklinicznych scenariuszach laboratoryjnych.
Podwyższony labirynt plus to metoda dokumentowania wpływu różnych potencjalnie anksjolitycznych metod leczenia na laboratoryjne modele gryzoni w bardziej humanitarny sposób w porównaniu z innymi metodami. Główną zaletą tej metody jest to, że opiera się ona na instynktownej skłonności gryzonia zarówno do ciemnych, jak i zamkniętych przestrzeni, a także na nieuwarunkowanym lęku wysokości i unikaniu otwartych przestrzeni. Collin Park, współpracownik z mojego laboratorium, pomoże zademonstrować tę procedurę.
Na kilka dni przed badaniem zajmij się zwierzętami, chwytając je za tułów i trzymając przez minutę, aby przyzwyczaić je do eksperymentatora. Następnie należy zmierzyć masę ciała zwierząt przed rozpoczęciem jakichkolwiek zabiegów, aby określić obliczenie dawki dla leczenia. Następnie zapoznaj zwierzęta z metodą gajnika dożołądkowego za pomocą wody po zgłębniku przez pięć dni przed suplementacją ketonów.
Do testu lęku użyj labiryntu z podwyższonym plusem lub aparatu EPM, aparatu w kształcie plusa z czterema ramionami, z których dwa są otwarte i dwa zamknięte. Oświetl aparat EPM, używając pośredniego oświetlenia z sufitu zamiast bezpośredniego oświetlenia. Upewnij się, że wszystkie cztery ramiona są podobnie oświetlone.
Podłącz klucz instalacyjny oprogramowania do śledzenia ruchu do portu USB 2.0 i zainstaluj oprogramowanie. Następnie zamocuj kamerę nad obszarem eksperymentu i upewnij się, że pozostanie nieruchoma przez cały czas trwania eksperymentu. Na koniec przeprowadź nowy eksperyment w systemie oprogramowania do śledzenia ruchu, korzystając z instrukcji obsługi.
Umieść zwierzę na obszarze doświadczalnym. Następnie rozpocznij proces akwizycji danych, naciskając przycisk start na panelu sterowania czasem. W pomieszczeniu testowym zbieraj dane EPM na dwa sposoby, ręcznie i za pomocą oprogramowania.
Oślepieni obserwatorzy oddzieleni są kurtyną. Poczekaj, aż rozpocznie się nagrywanie procesu śledzenia lub naciśnij przycisk stop na panelu sterowania czasem. Następnie usuń zwierzę z obszaru doświadczalnego.
Na koniec, aby uzyskać dostęp do narzędzia do analizy, naciśnij przycisk analizy na pasku asystenta eksperymentowania. Wybierz wersje próbne i przedziały czasowe, aby przeanalizować i wygenerować raport. Zacznij od przeniesienia szczurów z ich domowej klatki do pomieszczenia doświadczalnego 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.
Umieść szczura na przecięciu czterech ramion EPM, przodem do otwartego ramienia naprzeciwko eksperymentatora. Uruchom oprogramowanie do śledzenia wideo, a także ręcznie nagrywaj zachowanie zwierzęcia przez pięć minut. Następnie, jeśli zwierzę spadnie z EPM, podnieś je i umieść z powrotem w tym samym miejscu EPM, w którym spadło.
Wyklucz z analizy dane behawioralne tego zwierzęcia. Pod koniec pięciominutowego testu zatrzymaj oprogramowanie do śledzenia wideo. Wyjmij zwierzę z EPM i umieść je z powrotem w klatce domowej.
Na koniec wyczyść EPM detergentem dezynfekującym, a następnie wodą z kranu. Osusz urządzenie ręcznikami papierowymi. Po przewlekłym karmieniu szczury w grupie KSMCT spędzały znacznie więcej czasu w otwartych ramionach w porównaniu z grupą kontrolną.
Grupa KS spędziła znacznie więcej czasu w ośrodku w porównaniu z grupą kontrolną. A mniej czasu spędza się w zamkniętych ramionach w grupach LKE, KS, KSMCT w porównaniu z grupą kontrolną. Szczury w grupach KS i KSMCT pokonywały znacznie większe odległości w otwartych ramionach.
Podczas gdy szczury w grupach LKE, KS i KSMCT wykazywały znacznie mniejszą odległość przebytą w zamkniętych ramionach w porównaniu z grupą kontrolną. Co więcej, po siedmiu dniach stosowania przez zgłębnik doustny czas spędzony w otwartych ramionach był dłuższy w grupie KE, ale zmniejszył się w centrum w grupie KE, KS i KSMCT. Liczba wpisów do zamkniętych ramion była również istotnie niższa po siedmiu dniach podawania w grupach KE i KS.
Bardzo ważne jest, aby umieścić wszystkie szczury na sprzęcie w spójnym dworze na skrzyżowaniu, odwróconym tyłem do eksperymentatora. Test EPM na gryzoniach jest odpowiednią i czułą metodą do badania wpływu różnych zabiegów, które wpływają na obszary mózgu zaangażowane w działanie przeciwlękowe i mechanizmy działania.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół oceny poziomu lęku w modelach gryzoni z wykorzystaniem testu labiryntu w kształcie krzyża (EPM). Metoda ta, w połączeniu z oprogramowaniem do śledzenia wideo, pozwala na rzetelną dokumentację efektów potencjalnych terapii przeciwlękowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Nauka o zachowaniu
- Farmakologia
Wstęp
- Podwyższony labirynt krzyżowy służy do oceny zachowań związanych z lękiem u gryzoni.
- Wykorzystuje on naturalne instynkty gryzoni dotyczące przestrzeni otwartych i zamkniętych.
- Metoda ta jest uważana za bardziej humanitarną niż inne techniki oceny lęku.
- Śledzenie wideo zwiększa dokładność gromadzenia danych behawioralnych.
Cel badania
- Ocena wpływu różnych terapii przeciwlękowych na poziom lęku u gryzoni.
- Ustanowienie niezawodnego protokołu przeprowadzania testów EPM.
- Analiza zmian behawioralnych w odpowiedzi na leczenie w czasie.
Zastosowane metody
- Obsługa i aklimatyzacja gryzoni przed testowaniem.
- Wykorzystanie aparatury w postaci podwyższonego krzyżowego labiryntu do oceny lęku.
- Zastosowanie oprogramowania do śledzenia wideo w celu gromadzenia danych.
- Analiza danych behawioralnych metodą manualną oraz z wykorzystaniem oprogramowania.
Główne wyniki
- Szczury traktowane KSMCT spędzały więcej czasu w otwartych ramionach w porównaniu z grupą kontrolną.
- Zaobserwowano istotne różnice w dystansie pokonanym w ramionach otwartych w stosunku do ramion zamkniętych.
- Odnotowano zmiany behawioralne po przewlekłym podawaniu różnych substancji.
- Test EPM okazał się czuły w wykrywaniu wpływu terapii na lęk.
Wnioski
- EPM jest skuteczną metodą badania lęku w modelach gryzoni.
- Spójne rozmieszczanie zwierząt jest kluczowe dla uzyskania wiarygodnych wyników.
- Dalsze badania mogą służyć eksploracji mechanizmów działania leków przeciwlękowych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Test labiryntu krzyżowego (EPM) w połączeniu z wideotrakowaniem stanowi czułą i humanitarną metodę oceny efektów przeciwlękowych egzogennych suplementów ketonowych w modelach gryzoni. Podejście to wspiera wczesny etap walidacji celu poprzez ilościowe określenie zmian behawioralnych powiązanych ze szlakami lękowymi, co umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku terapii metabolicznych lub lekowych. Metoda ta generuje powtarzalne, ilościowe punkty końcowe, które stanowią podstawę do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w przedklinicznych procesach odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar czasu spędzonego w otwartych i zamkniętych ramionach labiryntu jako wskaźnika redukcji lęku.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ślepą, zautomatyzowaną analizę danych behawioralnych za pomocą śledzenia wideo, co ogranicza błąd obserwatora i zwiększa powtarzalność wyników.
- Wartość prognostyczna: Wykrywa efekty przeciwlękowe suplementów ketonowych, co zwiększa pewność w określaniu celów dla związków modulujących ośrodkowy układ nerwowy.
Przesiew i opracowanie testu
- Gotowość testu: Standaryzowany aparat EPM z jednolitym oświetleniem i stałym rozmieszczeniem zwierząt zapewnia wiarygodne wyniki bazowe we wszystkich grupach badawczych.
- Wyniki ilościowe: Śledzenie wideo dostarcza precyzyjnych parametrów dotyczących czasu spędzonego w ramionach otwartych i zamkniętych oraz przebytej odległości, co umożliwia charakterystykę zależności dawka-odpowiedź.
- Skalowalność: Protokół obsługuje schematy dawkowania przewlekłego (83 dni) oraz podprzewlekłego/ostrego (7 dni) w celu podłużnej oceny behawioralnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Pomiar zachowań związanych z lękiem u szczurów Sprague Dawley, które stanowią istotny w kontekście translacyjnym model do przesiewania zaburzeń neuropsychiatrycznych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Rozróżnienie efektów eksploracji ramion otwartych od unikania ramion zamkniętych w celu wyjaśnienia rozróżnienia między działaniem przeciwlękowym a sedatywnym.
- Ciągłość translacyjna: Wsparcie decyzji o dalszym rozwoju poprzez powiązanie interwencji opartych na metabolitach z mierzalnymi fenotypami behawioralnymi.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Test EPM wpisuje się w kontinuum procesu badawczego — od wczesnego testowania hipotez po identyfikację związków wiodących, zapewniając fenotypowanie behawioralne, które uzupełnia analizy biochemiczne i elektrofizjologiczne w procesie odkrywania leków neuropsychiatrycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków poprzez izolowanie efektów behawioralnych związanych z obwodami lękowymi, niezależnie od zakłócających efektów motorycznych.
- Przesiewanie: Dostarcza standaryzowanych, powtarzalnych fenotypów lękowych, niezbędnych do przesiewania bibliotek związków lub interwencji nutraceutycznych.
- Analityka: Generuje odczyty czasu spędzonego w ramieniu oraz przebytej odległości, które umożliwiają porównanie statystyczne grup badawczych i kontrolnych.
- Badania translacyjne: Łączy suplementację metabolitów z zachowaniem przypominającym lęk, co pozwala na przedkliniczną walidację zgodną z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę behawioralną do oceny różnych kandydatów na leki przeciwlękowe w modelach metabolicznych, farmakologicznych i genetycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstw
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w zakresie zaangażowania celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w zachowaniach związanych z lękiem.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność i skalowalność dzięki ślepemu śledzeniu wideo oraz spójnej konfiguracji aparatury.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez identyfikację rzeczywistych efektów przeciwlękowych przy jednoczesnym minimalizowaniu wyników fałszywie dodatnich wynikających ze zmian w aktywności lokomocyjnej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków opartych na ketonach lub aktywnych w OUN z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane wyniki behawioralne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza w zakresie obsługi gryzoni, testów behawioralnych oraz obsługi oprogramowania do śledzenia wideo.
- Zależność od aparatury EPM, systemu śledzenia kompatybilnego z USB oraz kontrolowanych warunków oświetleniowych.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa procedur aklimatyzacji zwierząt, dawkowania oraz ślepego zbierania danych.
- Przy adaptacji do różnych modeli gryzoni należy uwzględnić bazowy poziom lęku specyficzny dla gatunku i szczepu.
- Metoda ogranicza się do pomiaru zachowań lękowych; nie ocenia czynników zakłócających o charakterze poznawczym, motorycznym lub afektywnym bez zastosowania uzupełniających testów.
